[摘要] 目的 探讨不同喉部病变组织微淋巴管和微血管的密度及临床意义。 方法 选择喉鳞状细胞癌40例及喉鳞状上皮不典型增生和成人喉乳头状瘤患者各20例病变标本，分别进行微淋巴管及微血管染色。 结果 喉鳞状细胞癌、喉鳞状上皮不典型增生和喉乳头状瘤组织中LVD及MVD值之间差异均有统计学意义（P 0.05）。
1.2 试剂
鼠抗人CD105单克隆抗体、二甲胂酸钠、二甲基甲酰胺、左旋咪唑、萘酚AS—MX磷酸钠、腺苷—5’—磷酸钠、固蓝BB盐即用型免疫组化（SP）检测试剂盒及DAB显色剂均为美国Sigma公司产品，购自上海工硕生物技术有限公司。
1.3 方法
所有标本经石蜡包埋，连续切片，厚4 μm，脱蜡、水化、过氧化氢预孵、漂洗。取同一标本相邻切片分别采用酶组化染色法以腺苷—5’—磷酸钠进行淋巴管染色，链霉素亲和素—生物素—过氧化物酶复合物技术（SABC）进行CD105标记血管染色。按试剂盒说明书操作进行。PBS替代一抗作为阴性对照，试剂公司提供阳性样本作为阳性对照。
1.4 判断标准
腺苷—5’—磷酸钠标记于微淋巴管内皮细胞，阳性呈棕黄色。CD105标记于微血管内皮细胞，阳性呈棕黄色。LVD和MVD计数方法均为：于40倍光镜下寻找全部视野下淋巴管或血管高密度区域，再于400倍光镜下计数5个视野内微淋巴管/微血管数，求平均数作为该标本LVD或MVD。
1.5 统计学方法
采用SPSS 17.0进行统计学处理，计量资料采用t检验或方差分析，计数资料采用χ2检验，无进展生存曲线采用Kaplan—Meier法绘制，采用Log—rank法检验，采用COX模型进行多因素分析，P 0.05）。低分化癌组织MVD显著高于中、高分化癌组织，TNM Ⅲ～Ⅳ期癌组织MVD显著高于Ⅰ～Ⅱ期癌组织，淋巴结转移的癌组织MVD显著高于无淋巴结转移的癌组织（P < 0.01），声门上型癌组织MVD显著高于声门型癌组织（P < 0.05）。见表2。
2.3 LVD及MVD与喉鳞状细胞癌患者预后的关系
40例喉鳞状细胞癌患者根据LVD和MVD均值分为：高于均值为HLVD组和HMVD组，低于均值为LLVD组和LMVD组，HLVD组和LLVD组分别为24例和16例，HMVD组和LMVD组分别为22例和18例，根据术后随访结果，随访时间（31.48±10.57）个月，HLVD组和LLVD组中位无进展生存期分别为22.38个月、30.53个月，差异有统计学意义（χ2=4.396，P < 0.05）；HMVD组和LMVD组中位无进展生存期分别为23.67个月、31.49个月，差异有统计学意义（χ2=4.094，P < 0.05）。
2.4 喉鳞状细胞癌预后危险因素分析
对年龄、性别、肿瘤部位、LVD、MVD、组织学分级、TNM分期及淋巴结转移带入COX模型进行多因素生存分析，LVD、MVD及TNM分期是影响喉鳞状细胞癌患者生存时间的独立危险因素（P < 0.05），暴露与非暴露相对危险度比（RR）以LVD最高。
3 讨论
肿瘤组织的血管系统是肿瘤的生长、进展、转移和复发基础，近年来的研究均证明肿瘤组织中存在大量的新生血管，并受到如血管内皮生长因子—C（VEGF—C）、缺氧诱导因子—1（HIF—1）、肝细胞生长因子（HGF）、内皮素—1（ET—1）等多种生长因子的调控。相关的研究也是近几年肿瘤研究的热点，MVD计数是目前定量测定肿瘤组织内新生毛细血管的主要方法。组织细胞异常增殖是恶性变的基础，成人喉乳头状瘤是喉部的良性病变，但随着复发次数的增多，人乳头状瘤感染的组织细胞则可能出现异常增殖，则出现恶性变的可能；喉鳞状上皮不典型增生则已经出现异常增殖，是喉鳞状细胞癌的癌前病变。本研究将两者与喉鳞状细胞癌组织中MVD进行比较，结果三者组织中MVD呈现随病变恶性程度增加而升高的趋势，说明新生的微血管是喉鳞状细胞癌发生和进展的重要因素，异常增生甚至恶性变的组织细胞对营养的需求量显著高于正常组织或良性细胞，通过调高调控血管生成相关因子的表达，促进肿瘤内部微血管的生成。
肿瘤组织内新生淋巴管的存在与否仍存在争议，但目前许多的研究证实肿瘤内有新生的微淋巴管，并且多分布于肿瘤组织的边缘，且管壁结构不完整，瘤内密度则较小，与本次研究观察到的情况相似。这说明肿瘤内存在新生的淋巴管，由于肿瘤边缘细胞活性增殖程度最高，代谢旺盛，因而在肿瘤的边缘分布密度更高，并且由于管壁结构的不完整，通透性增加，更有利于肿瘤细胞的扩散，并随瘤内微淋巴管到达瘤外组织中淋巴管及淋巴结形成转移。微淋巴管促进肿瘤转移的观点仍存在一定争议，某些恶性肿瘤内部缺乏瘤内淋巴管。也有些研究表明，VEGF—C不仅能够促进微血管的生成，对微淋巴管生成也有调控作用，并与肿瘤转移关系密切。本研究结果显示，3种喉部病变组织中均存在微淋巴管，且LVD也随着病变恶性程度的增加而升高，说明LVD与MVD在喉鳞状细胞癌的进展过程中有相似的存在意义。 同时，本研究将LVD和MVD与喉癌临床特征的关系进行分析，结果也发现，两者主要与肿瘤本身组织学分级、TNM分期和淋巴结转移有关，并且随组织分化程度的降低及TNM分期的增加而升高，说明LVD、MVD与喉鳞状细胞癌的恶性程度和转移密切相关，而恶性程度和转移则是直接影响患者生存时间的关键。本研究将喉鳞状细胞癌患者按LVD和MVD均数进行分组，并对比各组在随访观察时间内的中位无进展生存期，结果发现，HLVD和HMVD组患者中位无进展生存期均显著少于LLVD和LMVD组患者，说明高密度的瘤内微淋巴管和微血管对喉鳞状细胞癌患者预后有显著的负性作用。通过COX多因素生存分析，证明LVD和MVD是喉鳞状细胞癌患者预后的负性因子，TNM分期也是影响喉鳞状细胞癌的危险因素，而TNM分期越高肿瘤侵袭性越强，转移的可能性大，正与LVD和MVD在肿瘤内尤其是边缘高密度分布有关。
综上所述，喉癌的发展和转移与微淋巴管及微血管的密度有关，两者都是喉癌预后的负性因子，定量测定可作为喉癌预后的指标。
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（收稿日期：2012—03—30）
