王卓,李娴静，张启春
(1.南京中医药大学药学院，江苏 南京 210023；
2.中国药科大学药物科学研究院，江苏 南京 211198)
巨噬细胞是机体中一类非常重要的免疫细胞，广泛分布于机体的各个组织中，参与调节机体的组织稳态[1]。巨噬细胞具有极强的可塑性和异质性，在LPS或干扰素的刺激下，表现出经典型极化即M1极化，表达大量的促炎因子如白介素-6(interleukin 6,IL-6)、白介素-1β(interleukin 1β，IL-1β)、白介素-12(interleukin 12，IL-12)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-α，TNF-α)以及诱导性一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)等，同时高表达抗原提呈相关分子如MHCII、CD86、CD80等，杀伤病原体和肿瘤细胞,发挥抗肿瘤抗感染的作用；
相反，巨噬细胞在IL-4或IL-13的刺激下，表现出替代性极化即M2极化，高表达抑炎因子TGF-β、IL-10、精氨酸酶(arginase 1,Arg1)等，抑制炎症反应，促进血管生成，参与组织重塑与修复。健康状态下，机体中的巨噬细胞处于M1与M2动态平衡中，若M1极化高强度持续存在，过度炎症导致自身组织损伤，若M2极化持续存在，则不利于机体有效清除病原体。因此，巨噬细胞极化的精确调控对于机体组织稳态至关重要。
谷氨酰胺(glutamine,Gln)是体内含量最丰富的氨基酸，在机体创伤及感染时，被视为“条件必需氨基酸”[3]。谷氨酰胺是许多细胞和组织最重要的能源物质，尤其是免疫细胞如淋巴细胞、中性粒细胞、巨噬细胞等，它们对Gln的利用率远远超过其他氨基酸[4]。但Gln对巨噬细胞表型的调控作用尚不明确，本实验研究Gln对原代巨噬细胞表型的调控作用，为Gln的临床应用奠定实验基础。
1.1 材料
1.1.1 实验动物 SPF级C57BL/6小鼠10只，体重20～22 g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，动物生产许可证号：SCXK(沪)2017-0005。实验动物使用许可证号：SYXK(苏)2018-2019。在中国药科大学新药安全评价研究中心饲养，自由进食饮水，适应性饲养3 d后进行实验。
1.1.2 主要试剂 DMEM(不含谷氨酰胺)购自Thermo Fisher公司；
Trizol、实时定量PCR反转录试剂盒、SYBR Green Real-time Master购自TaKaRa；
CB839购自MCE；
重组小鼠M-CSF购自Peprotech。
1.1.3 引物序列 具体见表1。
表1 Real-time PCR引物序列表
1.2 方法
1.2.1 骨髓来源巨噬细胞(bone marrow derived macrophage,BMDM)提取 将小鼠脱颈处死，浸泡于装有75%酒精的烧杯，浸泡2 min左右；
取下小鼠胫骨和股骨；
用注射器(2.5 mL)吸取PBS冲出骨髓中细胞；
离心，300 g，5 min,4 ℃；
2 mL培养基将细胞重悬，用70 μm滤器过滤细胞，去除结缔组织及骨头等非细胞成分；
将过滤所得的细胞再次离心，弃上清，加10 mL含100 ng·mL-1M-CSF的培养基重悬后加至10 cm培养皿，该细胞继续培养使其分化，每3 d换液一次，第6天后进行药物处理。
1.2.2 巨噬细胞药物处理 ①谷氨酰胺剥夺处理：BMDM培养至第6天，铺6孔板，每孔1×106个细胞；
将细胞分为两组：+ Gln组(正常培养基)及-Gln组(无谷氨酰胺培养基)，各6个孔，处理6 h后将6孔板取出提取RNA。②谷氨酰胺抑制剂处理：将细胞分为3组：对照组、IL-4(50 ng·mL-1)、IL-4+CB-839(1 μmol·L-1)，每组各6个孔，孵育6 h后将6孔板取出提取RNA。
1.2.3 给药后的巨噬细胞M1/M2标志物mRNA表达水平检测 Trizol法提取RNA，超微量分光光度计检测RNA的纯度和浓度，使用Takara逆转录试剂盒将RNA逆转为cDNA，去除基因组DNA，采用PrimerBank数据库提供的引物序列，由金斯瑞生物科技有限公司合成引物。配置PCR反应液，采用两步法PCR扩增程序，用每个样本的目的基因Ct值减去内参基因Ct值：ΔCt样本=Ct样本-Ct内参；
将对照组的ΔCt值取平均值ΔCt对照：ΔΔCt=ΔCt样本-ΔCt对照，计算出2-ΔΔCt。
2.1 谷氨酰胺剥夺对骨髓来源的巨噬细胞表型极化的影响 如图1所示，使用RT-PCR技术分别检测剥夺谷氨酰胺与未剥夺谷氨酰胺的BMDMs中M1型特异性标志基因IL-12、IL-6、IL-1β、iNOS的表达水平。结果显示，与未剥夺谷氨酰胺的BMDMs相比，剥夺谷氨酰胺的BMDMs的IL-12、IL-6、IL-1β、iNOS表达水平显著增加。剥夺谷氨酰胺后，巨噬细胞中IL-12、IL-6、IL-1β、iNOS的基因表达水平分别增加了7.5、80、24、48倍，差异具有统计学意义(P<0.05)。
A.IL-12基因表达；
B.IL-6基因表达；
C.IL-1β基因表达；
D.iNOS基因表达
2.2 谷氨酰胺酶抑制剂CB-839对M2型巨噬细胞表型极化的影响 如图2所示，与对照组相比，IL-4组均显著上调M2型特异性基因mRNA表达水平，如Arg1、Chil3、Mrc1表达水平相比对照组均显著增加，差异具有统计学意义，表明IL-4成功诱导巨噬细胞M2型极化。同时给予 CB-839后，IL-4诱导M2型标志物的表达均显著降低；
此外，CB-839处理亦能促进M1型特异性基因IL-1β和iNOS的表达水平增加。以上结果表明CB-839能够抑制BMDMs在IL-4诱导下向M2型极化的能力，增强其向M1型转化的能力。
A.Arg1；
B.Chil3；
C.Mrc1；
D.IL-1β；
E.iNOS的mRNA表达水平(n=6；
IL-4：50 ng·mL-1，CB-839：1 μmol·L-1)
本研究通过实时定量PCR方法研究谷氨酰胺代谢对巨噬细胞极化的作用，发现谷氨酰胺剥夺抑制M2型极化，而谷氨酰胺酶抑制剂CB-839处理亦能抑制巨噬细胞M2极化且增加M1型标志基因的表达，表明谷氨酰胺代谢过程对巨噬细胞具有调控作用。
谷氨酰胺通过氨基酸转运蛋白 ASCT2和 SN2穿过细胞膜，进入胞浆后，首先通过谷氨酰胺酶(GLS/GLS2)转化为谷氨酸，谷氨酸通过谷氨酸脱氢酶(GLUD)或转氨酶(如谷氨酸-草酰乙酸转氨酶(GOT)、谷氨酸-丙酮酸转氨酶(GPT)和磷酸丝氨酸转氨酶(PSAT)两条不同的途径转化为α-酮戊二酸(α-KG)[5]。谷氨酰胺酶抑制剂CB-839处理显著抑制巨噬细胞M2极化且增加M1型标志基因的表达，表明谷氨酰胺代谢过程中产生的代谢物α-KG可能是巨噬细胞表型极化的关键分子。αKG是双加氧酶催化底物羟基化的重要辅因子，其与Fe2+构成的双加氧酶酶活中心结合，在氧气的参与下，活化的两个氧原子分别进攻底物和αKG，进而生成羟基化的底物[5]。组蛋白去甲基化酶KDM家族、DNA去甲基化酶Tets家族及RNA去甲基化酶ALKBH5、FTO等均为双加氧酶。因此，αKG能够介导全基因组水平的组蛋白、DNA及RNA甲基化状态的改变，从而诱导细胞表观重编程[6-7]。Liu等[8]研究发现αKG能够抑制小鼠肺巨噬细胞M1极化，促进巨噬细胞M2极化，亦有研究显示谷氨酰胺代谢产生的αKG促进肿瘤微环境免疫抑制性髓细胞的形成[9]。因此，谷氨酰胺代谢可能通过αKG介导巨噬细胞表观重编程，从而促进巨噬细胞M2极化。CB-839已进入临床试验(NCT02071862)，已被证明在治疗三阴性乳腺癌方面具有疗效[10]，其有可能通过调控肿瘤微环境中的巨噬细胞M1极化从而增加其抗肿瘤功能。本研究为谷氨酰胺及其代谢过程抑制剂在临床的合理应用提供理论依据。
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