丁利超，陈明，陈妃，王品维
(1.缙云县林业局，浙江 丽水 321400；
2.杭州银帆环境科技有限公司，浙江 杭州 310000)
竹子是一种速生材料，竹碳汇具有重要的作用。竹醋液是在竹材烧炭过程中产生的一种含有80%以上水分以及有机酸、酚、醛、酮、醇、酯、杂环等多种有机物的黄褐色混合性液体[1]。竹醋液传统上用作杀菌剂、除臭剂、肥料、抗菌剂和促生长剂[2]。研究表明，竹醋液可用做烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratorysyndrome virus,PRRSV）以及口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus,FMDV）等的抗病毒剂[3]。近年来，对竹醋液应用方面的文献很少，几乎没有证据可以表明竹醋液比其它活性化合物更具有显著的成效。更早的一些研究可能夸大了竹醋液的应用范围，导致失去了市场关注。因此，进一步进行市场适应化产品的开发研究，将成为未来开拓竹醋液新用途的关键环节。为有效发挥竹资源的生态和经济优势，2021 年国家林业和草原局、国家发展改革委、科技部、工业和信息化部、财政部、自然资源部等10 部门联合印发《关于加快推进竹产业创新发展的意见》指出，要大力保护和培育优质竹林资源，构建完备的现代竹产业体系，到2025 年，全国竹产业总产值突破7 000 亿元；
到2035 年，全国竹产业总产值超过1万亿元。可以预见，我国未来竹炭产业将不断地发展壮大[4-6]，其副产物竹醋液由于焦油气味、有机酸含量不足以及应用范围狭小等原因而没有大量使用，造成严重过剩[7]。
为了扩展竹醋液的应用范围和利用价值，本文将竹醋液开发为新型的生活垃圾处理剂，提升竹子的有效应用和竹炭副产物的附加值。
1.1 试验材料
1.1.1 供试药剂和药液配制
供试药剂：试验所用竹醋液由浙江宁波奉化竹炭厂提供，均为机械式炭化炉烧制竹炭时分离的副产物。
药液配制：将供试竹醋液与水分别按1∶0、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16 质量比例进行配制。
1.1.2 供试病原菌、病毒和卫生害虫 5 种病原菌分别为大肠杆菌Escherichia coli、猪沙门氏菌Salmonella choleraesuis、志贺氏菌Shigella castellani、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis、霍乱弧菌Vibrio cholerae；
4 种病毒分别为肝炎病毒Hepatitis viruses、胃肠炎病毒Gastroenteritis virus、脊髓灰质炎病毒Poliomyelitis virus、柯萨奇病毒Coxsachie virus；
4 种卫生害虫分别为家蝇Musca domestica和3 种寄生虫（结肠小袋纤毛虫Balantidium coli malmsten、短膜壳绦虫Hymenolepiasis nana、蛲虫Enterobius vermicularis），以上供试病原图菌、病毒和害虫均由浙江省疾病控制中心提供。
1.2 试验方法
1.2.1 供试竹醋液的成分分析 取500 g 竹醋液原液进行减压蒸馏，回收蒸馏竹醋液488.5 g、蒸馏残留物竹焦油10.5 g，回收率为99.8%。蒸馏竹醋液中的有机酸（以乙酸计）含量采用氢氧化钠滴定法测定。将10.5 g 竹焦油溶解于500 mL 无水乙醇，并经过孔径0.22 μm 真空装置抽滤后，密闭冷藏于4 °C 冰箱，化学成分及其相对含量使用气质联用仪器分析法测定。
1.2.2 GC-MS 分析 采用7890A 气质联用仪（安捷伦科技有限公司）。气质联用仪条件如下：
色谱柱：RTX-WAX 石英毛细柱（30 m×0.32 mm×0.25 μm）；
色谱柱箱升温程序：50 ℃保持3 min，以3 ℃·min-1升至100 ℃，以6 ℃·min-1升至200℃，再以10 ℃·min-1升至230℃保持15 min；
载气为氦气（99.999%），流速1.50 mL·min-1，压力88.3 k Pa，进样温度250 ℃；
进样0.2 μL；
分流比100∶1。
质谱条件：电子轰击（EI）离子源；
电子能量70 eV；
传输线温度230 ℃；
四极杆质量分离器；
离子源温度200 ℃；
检测电压0.85 kV；
质量扫描范围m/z 30～ 500；
溶剂截流：0.5 min；
记录1.0～ 55.0 min 信号。
1.2.3 竹醋液室内杀菌活性测定方法
1.2.3.1 抑制细菌活性测定试验 本试验采用抑菌圈法[8-10]，将竹醋液对5 种供试细菌进行抑菌活性测定。首先根据供试细菌菌种制备相应培养基进行菌种培养，然后用打孔器将实验室用的滤纸打成直径0.5 cm 的圆片，装在试管中密封灭菌（121 ℃，20 min）。挑选菌种制成菌悬液，分别取1 mL 菌悬液至已灭菌的培养皿（直径为90 mm）中，倒入温度45 ℃的4 mL 融化的PDA 培养基（马铃薯200 g、琼脂20 g、葡萄糖20 g、去离子水1 L），使培养基与供试菌液充分混匀，静置凝成平板。用无菌镊子分别将一片滤纸放入已配制好的不同浓度竹醋液水剂中浸透，夹出时在容器边缘停靠片刻，滤掉多余的药液，把滤纸片放在平板中已凝好的培养基的中央，每个培养皿放一片，用镊子稍用力按压，使滤纸片与培养基充分紧贴。本试验设6 组剂量，按照上述方法，将每个处理剂量分别做3 个重复，以灭菌水浸湿的滤纸片作为空白对照。最后将所有培养皿均置于人工培养箱（温度为27～ 28 ℃）中进行培养48 h，观察并用游标卡尺测量抑菌圈直径（mm）大小。按照孙广宇等[11]提供的方法计算菌落生长抑制率，即：
1.2.3.2 抗病毒活性测定试验 本试验采用悬液法[12-13]测定竹醋液对病毒的灭活效果。首先制备供试病毒悬液，根据供试病毒种类制备相应培养基。分别取出低温保存的肝炎病毒、胃肠炎病毒、脊髓灰质炎病毒及柯萨奇病毒4 种病毒毒种，经融化后分别接种于敏感细胞，置于恒温培养箱（37℃）中培养24 h，获得含有病毒的悬液，反复冻融3 次，分别取一定量加入到离心管中离心10 min，提取上清液分装于无菌微量管中；
然后将不同浓度的竹醋液分别滴加到病毒悬液中并立即混匀，再分别接种于敏感细胞，置于恒温培养箱（37℃）中连续培养3 d，同时设置细胞对照，每天观察并记录细胞的生长状况。本试验设6 组剂量，按照上述实验方法，将每个处理剂量均重复3 次。按Reed-Muench 方法计算各病毒半数组织感染量（TCID50），最后计算竹醋液对病毒的杀灭率，即：
TCID50计算方法如下：
1.2.3.3 抑制卫生害虫活性测定试验
（1）抑制家蝇活性测定。将家蝇置于昆虫室（温度为25℃，相对湿度为60%～ 70%）内进行饲养繁殖1～2 代。选取羽化4 d 后的健壮雌蝇，采用室内点滴法测定[14]，室温控制在（26±2）℃，相对湿度为60%±10%，用微量点滴器盛装已配制好的竹醋液，点滴时采用标准定量点滴器将药液滴于雌蝇胸部背板处，每头雌蝇仅滴一滴。本试验设6 组剂量，每个处理剂量均重复3 次，设空白对照点滴蒸馏水，然后添加适量人工饲料进行饲养并观察。记录雌蝇的中毒状态和死亡情况，根据死亡和成活数量计算雌蝇的死亡率。
（2）抑制结肠小袋纤毛虫活性测定。本试验采用涂片镜检法进行测定[14]。首先制备RSS 培养基（主要组分Ringer 液、灭能小牛血清、消毒米粉、青霉素、链霉素），将供试结肠小袋纤毛虫接种于RSS 培养基中，充分混匀后盖上棉塞，将其放置于恒温培养箱（37 ℃）中培养24～ 36 h，将已经配制好的竹醋液分别加入到已转种的新培养管中，每管加等量的不同浓度竹醋液，对照组加入同等量蒸馏水，每隔一段时间吸取适量培养液涂片，经镜检观察并记录结肠小袋虫滋养体的生长情况和数量变化。试验设6 组剂量，每个处理剂量均重复3 次，根据所记录数据计算结肠小袋纤毛虫的死亡率。
（3）抑制短膜壳绦虫活性测定。试验方法与培养基制备参考文献[15]进行配制和测定。将制备好的短膜壳绦虫培养液平均分为7 瓶，其中6 瓶为处理组培养基，添加等量已配制好的竹醋液，对照组不添加药剂，将供试虫体分别放入6 瓶含药剂的实验组培养基和无药剂的对照组培养基中，培养基均置于恒温培养箱（37 ℃±1 ℃）中连续培养3 d，期间每隔1 d（24 h）换一次培养液，对虫体的活动状态及形态变化进行观察并记录。培养72 h 后，分别将各培养液中的虫体取出，经Bounis 液固定并HE 染色，置于光镜下观察并记录虫体组织变化。按照以上操作方法，分别对6 组剂量做3 次重复实验，根据所记录数据计算短膜壳绦虫的死亡率。
（4）抑制蛲虫活性测定。根据何竞智等[16]实验方法测定。蛲虫卵采自感染蛲虫的小白鼠Mus musculus体内，将蛲虫卵均分为7 组，用竹醋对6 组蛲虫卵进行浸泡杀灭观察，空白对照用蒸馏水浸泡观察。鉴别蛲虫卵死活采用人工胃液孵化法进行鉴别，将实验组和对照组蛲虫卵于37 ℃培养72 h 后分别将蛲虫卵置于光镜下观察蛲虫卵死亡情况。以上操作3 次重复，根据所记录数据计算蛲虫卵死亡率。
2.1 竹醋液的化学成分
经蒸馏后称量得到竹醋液原液中竹焦油含量为2.1%，用氢氧化钠滴定法测得竹醋液中有机酸（以乙酸计）含量为7.2%。其中，从竹焦油中共检测到7 种化合物，分别为乙酸、2-甲氧基四氢呋喃、苯酚、4-乙基苯酚、愈创木酚、γ-羟基丁酸邻苯二甲酸二丁酯（见图1)，其相对含量用面积归一法计算出从大到的顺序为：愈创木酚（37.83%）>苯酚（35.36%）>γ-羟基丁酸（12.41%）>4-乙基苯酚（6.16% ）>邻苯二甲酸二丁酯（5.42%）>乙酸（1.78%）>2-甲氧基四氢呋喃（1.04%）。
图1 竹焦油中总离子流色谱图Fig.1 Total ion chromatogram of bamboo tar
2.2 竹醋液杀菌、抗病毒活性和防治害虫测定结果
2.2.1 杀菌效果的测定结果 不同浓度竹醋液制剂杀菌效果见表1。
表1 不同浓度竹醋液对细菌的杀菌效果Tab.1 Effect of bamboo pyroligneous liquor with different concentration on different bacteria
由表1 可知，有机酸浓度为7.2%竹醋液对大肠杆菌、猪沙门氏菌、志贺氏菌、枯草芽孢杆菌和霍乱弧菌的杀菌效果分别为83.2%、86.7%、81.5%、87.3%和84.6%，杀菌效果极佳；
有机酸浓度为3.6%（稀释1 倍）和2.4%（稀释2 倍）竹醋液对5 种细菌的杀菌效果为60%～ 75%，杀菌效果较好；
有机酸浓度为1.44%（稀释4倍）竹醋液对细菌的杀菌效果为50%左右，相较于有机酸浓度为3.6%和2.4%竹醋液对5 种细菌的杀菌效果均有显著差异（P<0.05）；
而有机酸浓度为0.8%（稀释8 倍）和0.42%（稀释16 倍）竹醋液对5 种细菌的杀菌效果最差，与稀释0～ 4 倍竹醋液对5 种细菌的杀菌效果均有显著差异（P<0.05），且对细菌的杀菌效果均在50%以下。可见有机酸浓度为1.44%～ 7.2%竹醋液对5 种细菌的杀菌效果均可达到50%以上，即竹醋液最佳稀释倍数为0～ 4 倍。
2.2.2 防治病毒的效果 不同浓度竹醋液制剂对病毒的杀灭率见表2。由表2 可知，有机酸浓度7.2%竹醋液对肝炎病毒、胃肠炎病毒、脊髓灰质炎病毒的杀灭率分别为65.3%、53.6%和57.1%，并且有机酸浓度为3.6%和7.2% 时，2 个浓度的竹醋液对这3 种病毒杀灭率没有显著差异，防治效果较好，但对于柯萨奇病毒的杀灭率，2 个浓度有显著差异（P<0.05），有机酸浓度7.2%竹醋液比有机酸浓度3.6%竹醋液效果更佳，杀灭率分别为66.3%和54.2%。有机酸浓度2.4%～ 3.6%竹醋液对4 种病毒的杀灭率为50%～ 60%，防治效果较好；
有机酸浓度为1.44%竹醋液对病毒的杀灭率为40%左右，相较有机酸浓度为3.6%和2.4%竹醋液对病毒的防治效果有显著差异（P<0.05）；
而有机酸浓度0.8%和0.42%竹醋液对4 种病毒的杀灭效果均在40%以下，与有机酸浓度2.4%～ 7.2%的处理组的防治效果有显著差异（P<0.05）。由此可知，有机酸浓度为2.4%～ 7.2%竹醋液对4 种病毒的抗病毒效果均可达到50%以上，即最佳稀释倍数为0～ 2 倍。
表2 不同浓度竹醋液对病毒的杀灭率Tab.2 Effect of bamboo pyroligneous liquor with different concentration on different virus
2.2.3 防治卫生害虫的测定结果 不同浓度竹醋液制剂对家蝇和3 种寄生虫的杀灭率见表3。由表3 可知，有机酸浓度7.2%竹醋液对家蝇、结肠小袋纤毛虫、短膜壳绦虫和蛲虫的杀灭率分别为93.0%、92.5%、91.2%和91.4%，防治效果最佳，与有机酸浓度为0.42%～ 3.6%竹醋液处理组均有显著性差异（P<0.05）；
有机酸浓度2.4%～ 3.6%竹醋液对家蝇和3 种寄生虫的杀灭率为70%～ 80%，防治效果较好，与有机酸浓度0.42%～ 1.44%竹醋液处理组有显著性差异（P<0.05）；
有机酸浓度1.44%竹醋液对家蝇和3 种寄生虫的杀灭率为60%左右，防治效果一般，但显著好于0.4%～ 0.8%竹醋液处理组，后者对家蝇和3 种寄生虫的防治效果较差，杀灭率均在40%以下。因此，有机酸浓度1.44%～ 7.2%竹醋液对家蝇和3 种寄生虫的杀灭率均达到50%以上，即最佳稀释浓度为0～ 4 倍。
表3 不同浓度竹醋液对4 种卫生害虫的杀灭率Tab.3 Effect of bamboo pyroligneous liquor with different concentration on different parasite
3.1 结论
本试验所用竹醋液的有机酸含量比较高，对其杀菌、抗病毒和抑制卫生害虫作用初步研究表明，竹醋液对生活垃圾中常见的细菌、病毒及卫生害虫等均具有较强的杀灭作用。竹醋液对病菌的杀灭活性与其有机酸浓度成正比，即有机酸浓度越高，杀菌抗病毒效果越强。竹醋液对垃圾中病菌的杀灭作用的有效活性成分为有机酸，有机酸浓度2.4%～ 7.2%竹醋液对垃圾中细菌、病毒和卫生害虫的杀灭率达50%以上，可以作为生活垃圾处理剂。
3.2 讨论
竹醋液对细菌、病毒的抑杀活性显著，具有广阔的开发利用前景[17-18]。然而，我国对竹醋液的研究开发思路还停留在效果第一的初级阶段，现今的研究应该着眼未来，以安全和舒服为第一、效果为第二的研究思路为指导，竹醋液为天然物品，符合人们追求自然的天性，但需要解决因竹醋液中存在1%～ 5%的水溶性竹焦油（主要为苯酚类物质）存在的舒服性与安全性问题。竹材的种类、质量、生产设备和工艺技术、收集方法、包装、储存方法与条件等不同都会造成竹醋液各组分含量和理化性质的差异。要想充分发挥竹醋液的优良特性，扩大其应用前景，首先生产设备和工艺技术等因素的综合研究有待加强，以确保产品质量的稳定与标准化。其次还应加强对竹醋液作用机理的研究，探明竹醋液各组分含量和存在形式与组分的关系，并研究其各种成分的有效性以及存在的副作用，为竹醋液开拓新的应用领域打下基础。
生活垃圾的处理一直是困扰人们的一个难题，尤其是大中城市，每天收集的垃圾量已超过负荷，而其中大部分采用集中填埋的方式进行处理[17-19]。生活垃圾中的细菌、病毒等微生物以及家蝇、蚊虫之类生物对人类产生很大危害。由于大量的城市生活垃圾产生于居民稠密区，垃圾收集点、中转站亦就近建在居民稠密区，因而垃圾收集点、中转站产生的垃圾臭气对周围环境造成了极为严重的影响，亦会对周边居民身体健康产生危害[19]。因此，本研究不仅实现了竹醋液的大量应用，实现废物高值化利用的目的，而且解决了生活垃圾的临时处理的恶臭和有害生物传播难题。
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