赵孟良 郭怡婷 任延靖
（1. 青海大学农林科学院 青海省蔬菜遗传与生理重点实验室，西宁 810016；
2. 青海大学三江源生态和高原农牧业国家重点实验室，西宁 810016）
菊芋（Helianthus tuberosusL.）又名洋姜，鬼子姜，属菊科向日葵属多年生草本植物［1］，原产自北美，18 世纪末传入我国，常规用于腌制咸菜，随着其开发利用价值的发掘，菊芋已被广泛应用于食品开发、药用、工业、绿化观赏等领域［2-7］。同时菊芋又具有较强的环境适应性，它可以在干旱地、沙荒地、盐碱地等不同类型的土壤中种植，且能够正常生长［8-10］，并产生相当可观的生物量。由于菊芋对贫瘠土地较强的适应性，已被广泛应用于生态治理等领域［11-13］。除此之外，菊芋还可用于菊粉的提取以及功能食品［14］、动物饲料［15］等的开发。
WRKY 转录因子作为植物中最常见的一类转录因子家族之一，具有高度的保守序列和特殊功能，能够参与植物响应生物和非生物胁迫［16］。研究发现，OsWRKY67 参与调控水稻（Oryza sativaL.）响应多种非生物胁迫，通过ABA 信号通路介导负向调控水稻苗期耐旱性［17］，而过表达水稻OsWRKY6能提高水稻对病原物的抵抗性［18］。在牛耳草（Boea hygrometrica（Bunge）R. Br.）中，BhWRKY11 转 录因子可通过调控BhGolS1基因的表达，促进转基因烟草对干旱胁迫的耐受性［19］；
在小麦中TaWRKYK2可与STZ和下游的抗旱基因RD29B启动子结合，对干旱胁迫有积极的调控作用。
截至目前，空心菜（Ipomoea aquatica）［20］、睡莲（Nymphaea colorata）［21］等WRKY 转录因子已有相关研究，但未见到有关菊芋WRKY 转录因子家族的相关研究。
本研究以菊芋的叶片为材料，进行转录组学测序，通过分析转录组数据中的WRKY 转录因子家族，对其进行鉴定及表达分析，以期明晰与菊芋响应干旱胁迫密切相关的WRKY 基因，为今后菊芋WRKY基因的克隆及功能验证奠定理论基础。
1.1 材料
选取前期进行转录组与代谢组测序的青芋2 号菊芋品种为研究材料，于2020年4月种植于青海大学农林科学院园艺研究所试验基地，正常田间肥水管理，9月下旬于开花期进行取样，选取盛花时期的7 个组织（包括根、块茎、花茎、叶、花瓣、管状花和幼嫩种子），液氮速冻后，置于-80℃贮藏备用，每个样品选取3 个生物学重复。
同时，采用25% PEG-6000 模拟干旱胁迫，分别选取处理0、18、24 和36 h 的菊芋叶片与幼根，液氮速冻后，置于-80℃贮藏备用，每个样品选取3个生物学重复。
1.2 方法
1.2.1 RNA 的提取及第一链cDNA 合成 采用TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit 提取总RNA，用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测RNA 纯度及完整性，微量紫外分光光度计检测RNA 浓度及质量，采用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 合成cDNA，将cDNA 溶液稀释为100 ng/μL，-20℃保存备用。
1.2.2HtWRKY基因的筛选 根据干旱胁迫下菊芋叶片的转录组信息（SUB8106956）、转录组组装结果以及转录组测序注释文件，以WRKY 为关键词，依次在NR、Swissprot、Tremble 和KEGG 注释文件中进行搜索，根据搜索到的测序序列Cluster 编号查找序列信息，将查找到的Cluster 序列提交至NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/），进行在线BLAST 分析，再将获得的比对序列提交至在线工具ExPASy-ProtParam tool（https://web.expasy.org/protparam/） 中分析其序列特征，采用MEME3.0 分析序列的motif结构域。
根据Cluster 电子序列及NCBI 的比对结果，采用DNAMAN 9.0 软件进行序列相似度分析，选取重叠区域，利用Primer Premier 5.0 软件设计实时荧光定量PCR 引物，并且通过奥科（杨凌）生物工程股份有限公司合成引物，引物序列见附表1。
1.2.3 进化树分析 选取能够比对到NCBI 中的74个菊芋的Cluster 片段，以及NCBI 中下载的30 个拟南芥、30 个向日葵、40 个莴苣的WRKY 基因，采用MEGA X 软件的最大似然方法构建系统进化树。
1.2.4 组织差异表达分析与干旱胁迫诱导表达分析 通过实时定量PCR（RT-qPCR）检测基因的表达情况，以25sRNA和Clath-3为内参基因，RTqPCR 反应体系为2 × Unique AptamerTMqPCR SYBR Green Master Mix（No Rox）10 μL、上下游引物各0.8 μL、模板cDNA（200 ng/μL）1 μL 和双蒸水7.4 μL。扩增程序为95℃ 15 min；
95℃ 10 s，58℃ 20 s，72℃ 20 s，40 个循环。熔解曲线：95℃ 15 s，60℃1 min，95℃ 1 min，30 个循环，降温：40℃ 30 s。采用2-ΔΔCt方法计算相对表达量。
2.1 HtWRKY基因家族成员的鉴定及蛋白结构分析
通过筛选转录组数据，共发现117 个WRKY 基因，与NCBI 中WRKY 基因比对，发现部分Cluster序列比对到同一个WRKY 基因，综合整理后，共鉴定出74 个WRKY 基因（附表2）。Expasy 分析显示，序列长度为510-2 040 bp，平均序列长度为1 105 bp，编码氨基酸数量为169-679 个，平均367 个，其中，序列最短的氨基酸是HtWRKY75-3，序列最长的是HtWRKY2-3，分子量为18 882.98-74 247.19，平均为40 639.5，等电点为5.13-10.19，最低的是HtWRKY40-2，最高的是HtWRKY51-3，亲水性分析显示，HtWRKY65-3 具有较强的亲水性，HtWRKY7-2 具有明显的疏水性。
2.2 HtWRKY基因的保守基序分析
利用MEME 在线软件对菊芋74 个WRKY 基因的保守序列进行分析，结果（图1）显示，HtWRKY基因含有保守的Motif 基序的长度为25-50 个碱基。
图1 HtWRKY 基因的保守基序标识Fig. 1 Conversed motif logo of HtWRKY genes
2.3 HtWRKY基因系统进化树分析
利用MEGA X 软件的最大似然法构建74 个HtWRKY基因的系统进化树（图2），被分为四大类。
图2 HtWRKY 基因的聚类分析图及基序位置Fig. 2 Phylogenetic relationship and motif locations of HtWRKY genes
在这四大类中，第一类包含23 个基因，检测到的保守Motif 数量为2-11 个不等，平均含有5.8个Motif，主要含有的保守基序为Motif 1、Motif 2、Motif 3、Motif 4、Motif 8 和Motif 9；
第二类包含19个基因，检测到的保守Motif 数量为2-9 个，平均含有6 个Motif，主要含有的保守基序为Motif 1、Motif 2、Motif 3 和Motif 6；
第三类仅包含3 个基因，检测到的保守Motif 数量分别是2、4 和6 个，平均含有4 个Motif；
第四类包含29 个基因，检测到的保守Motif 数量为2-11 个，平均含有7 个Motif，主要含有的保守基序为Motif 1、Motif 2、Motif 3、Motif 4、Motif 8、Motif 9、Motif 14 和Motif 15。
2.4 WRKY家族基因的进化分析
为了进一步分析转录因子HtWRKY 与其他物种WRKY 基因之间的亲缘关系，选取与菊芋（Helianthus tuberosusL.）亲缘关系较近的向日葵（Helianthus annuus）和莴苣（Lactuca sativa），以及模式植物拟南芥（Arabidopsis thaliana）进行家族进化分析，利用MEGA X 软件对74 个菊芋WRKY 家族基因、30个向日葵WRKY 家族基因、40 个莴苣WRKY 家族基因以及30 个拟南芥WRKY 家族基因进行系统进化分析。结果（图3）显示，这些WRKY 基因分为了六大类，第一类33 个基因，其中菊芋WRKY 占27 个，其他分别是4 个莴苣和2 个拟南芥WRKY 基因；
第二类40 个基因，分别包括菊芋、向日葵、莴苣和拟南芥的WRKY 基因15、8、11 和6 个，大部分HtWRKY 与这3 个物种的WRKY 聚为一小类；
第三类2 个基因，分别是莴苣WRKY51 和拟南芥WRKY22；
第四类23 个基因，分别包括菊芋、向日葵、莴苣和拟南芥WRKY 基因8、8、5 和2 个；
第五类10 个基因，包含2 个HtWRKY、3 个HaWRKY、1 个LsWRKY 和4 个AtWRKY；
第 六 类65 个 基因， 包 含21 个HtWRKY、11 个HaWRKY、18 个LsWRKY 和15 个AtWRKY，大部分HtWRKY 与这3 个物种中的WRKY 聚为一小类。
图3 4 个物种WRKY 转录因子的系统进化树Fig. 3 Phylogenetic tree of WRKY transcription factors in four species
2.5 HtWRKY家族基因的组织特异性表达分析
为进一步明晰HtWRKYs在不同组织的表达特性，选取菊芋的种子、根、茎、叶、花瓣及块茎为材料，以花为参考，运用RT-qPCR 分析HtWRKY的表达特性，结果（图4）显示，种子中，HtWRKY6-1、HtWRKY7-4、HtWRKY65-5、HtWRKY33-1、HtWRKY6-6、HtWRKY40-4、HtWRKY17-3、HtWRKY13、HtWRKY9-1、HtWRKY22、HtWRKY33-2和HtWRKY44表达量较高；
根中，HtWRKY33-1、HtWRKY32-2、HtWRKY51-4、HtWRKY40-4、HtWRKY21、HtWRKY13和HtWRKY33-2表 达 量 较高；
茎中，HtWRKY6-6、HtWRKY24、HtWRKY17-3、HtWRKY13、HtWRKY22、HtWRKY33-2表达量较高；
叶 片 中，HtWRKY32-2、HtWRKY51-4、HtWRKY6-6、HtWRKY21、HtWRKY22和HtWRKY33-2表达量较高；
花 瓣 中，HtWRKY41、HtWRKY26-3、HtWRKY51-4、H t W R K Y 6-6、H t W R K Y 4 0-4、H t W R K Y 2 4、HtWRKY17-3、HtWRKY13、HtWRKY9-1、HtWRKY22和HtWRKY33-2表达量较高，且花瓣中的表达量普遍高于种子、根、叶片和茎中的表达量；
块茎中，HtWRKY51-4、HtWRKY17-3和HtWRKY13表达量较高，说明菊芋WRKY家族基因的表达具有明显的组织特异性。
图4 HtWRKY 基因在PEG-6000 模拟干旱胁迫下的组织特异性表达水平热图Fig. 4 Tissue-specificity expression heatmap of HtWRKY genes under PEG-6000 -simulated drought stresses
2.6 HtWRKY家族基因在干旱胁迫后的诱导表达
参考前期菊芋叶片在干旱胁迫后的转录组信息，分析所鉴定出的74 个WRKY 基因在干旱胁迫后的表达水平变化，结果（图5）显示，有11 个基因明显受到干旱胁迫的诱导表达，在PEG-6000 模拟干旱胁迫18 h 时表达量呈现显著上升的变化，分别为HtWRKY70、HtWRKY50、HtWRKY17-2、HtWRKY2-4、HtWRKY6-2、HtWRKY40-1、HtWRKY75-2、H t W R K Y 7-5、H t W R K Y 5 5、H t W R K Y 3 3-2和HtWRKY9-2；
有7 个基因在PEG-6000 模拟干旱胁迫24 h 表达量呈现显著上升变化的趋势，分别 为HtWRKY51-1、HtWRKY6-1、HtWRKY27、HtWRKY26-1、HtWRKY40-2、HtWRKY51-3 和HtWRKY75-3；
有2 个基因在PEG-6000 模拟干旱胁迫24-36 h 表达量呈现显著上升变化的趋势，分别为HtWRKY6-5和HtWRKY40-4。
图5 74 个HtWRKY 基因在PEG-6000 模拟干旱胁迫下的菊芋叶片中的表达水平热图Fig. 5 Expression heatmap of 74 HtWRKY genes under PEG-6000-simulated drought stress in H. tuberosus leaves
在根中，对干旱胁迫条件下74 个菊芋WRKY基因的表达进行RT-qPCR 检测，鉴定出19 个HtWRKY基因在PEG-6000 模拟干旱胁迫的菊芋根中有表达，结果（图6）显示，与CK 相比，除了HtWRKY55在3 个处理时间下的相对表达量呈现先升高之后逐渐降低的趋势，其他18 个HtWRKYs均呈现“升高-降低-升高”的变化趋势。其中，HtWRKY20-1、HtWRKY32-1和HtWRKY75-3在干旱胁迫18 h 的相对表达量较高；
HtWRKY51-1、HtWRKY2-1、HtWRKY65-5、HtWRKY58-2和HtWRKY75-3在干旱胁迫36 h 的相对表达量较高。
图6 19 个HtWRKY 基因在干旱胁迫下菊芋根中的表达情况Fig. 6 Expressions of 19 HtWRKY genes in the Jerusalem artichoke roots under drought stress H. tuberosus
总之，发现HtWRKY51-1和HtWRKY75-3在菊芋叶片和根中均呈现高表达特性。
WRKY 转录因子家族在生物和非生物胁迫响应中起着重要作用［22］，这与高等植物的多种生物过程有关。WRKY 蛋白可以通过在其启动子位点与W-box 特异性结合来诱导或抑制其下游基因的表达，并最终激活其应激反应［23］，据报道，多数WRKY基因在干旱胁迫下呈现上调表达的特性。Chu 等［24］研究发现，棉花GhWRKY41正向调控转基因烟草的耐盐胁迫和耐旱性。Chen 等［25］报道了拟南芥中WRKY46、WRKY54 和WRKY70 转录因子参与了干旱反应。Zhang 等［26］认为WRKYs 参与了地梢 瓜（Cynanchum thesioides（Freyn）K. Schum.）抵御干旱胁迫的反应。EI-Esawi 等［27］研究发现，过表达AtWRKY30 转录因子可以提高小麦（Triticum aestivumL.）的耐热性和耐旱性。Ghodke 等［28］分析了不同洋葱（Allium cepaL.）基因型对干旱胁迫的响应发现，在抗逆品种中WRKY 转录因子的表达表现出高度上调，然而，目前对菊芋中WRKY基因的分布和功能少见报道。
本研究通过对干旱胁迫下的菊芋叶片进行转录组测序分析，筛选出了响应干旱胁迫的117 个WRKY 基因，通过与NCBI 的比对分析，去除比对重复的序列后，共鉴定出74 个WRKY 基因，分析其保守序列，发现含有保守Motif 基序的长度为25-50 个碱基不等。利用MEGA X 软件的最大似然方法构建74 个HtWRKY基因的系统进化树，结果显示，这些基因能够被分为4 大类，第一类包含23 个基因，第二类包含19 个基因，第三类仅包含3 个基因，第四类包含29 个基因。进化分析结果显示，这些WRKY 基因分为了六大类，第一类包含33 个基因，第二类包含40 个基因，第三类仅包含2 个基因，第四类包含23 个基因，第五类共包含10 个基因，第六类包含65 个基因。目前，关于HtWRKYs在干旱胁迫下不同组织中的表达模式尚未见报道，本研究通过PEG-6000 模拟干旱胁迫，对不同菊芋部位的相对表达量进行了RT-qPCR 测定，结果发现，HtWRKY75-3在干旱胁迫36 h 时的表达量最高，达到188.71，后续可对该基因进行克隆验证等工作。
植物体内的转录因子家族基因在植物应对逆境胁迫中起着至关重要的作用，转录因子主要根据其保守的DBDs［29］的特征氨基酸序列被分为几个家族组。其中，DREB/CBF、NAC、MYB、WRKY 和bZIP 家族是在干旱过程中起作用的主要转录因子。
WRKY 蛋白属于锌指转录因子中WRKY-GCM1的超大家族［30］，存在于大多数植物中，并有助于提高植物抵御生物和非生物胁迫的能力［31-32］。研究发现OsWRKY11参与植物的干旱和热响应［33］。OsWRKY45被认为对ABA 有响应，并在气孔关闭中发挥作用，以提高植物应对干旱胁迫的能力［34］。HvWRKY38在大麦抵御干旱和寒冷时发挥着积极作用［35］。TaWRKY44的拟南芥超表达株系对ABA、干旱和盐等胁迫处理的敏感性高于野生型，这与本研究中克隆获得的菊芋WRKY 基因的功能相同［36］。
本研究结果还表明，HtWRKY参与了抵御干旱胁迫的作用，并揭示了HtWRKY基因与其他作物中已鉴定的WRKYs 的系统发育关系。综上所述，这些结果为今后深入了解菊芋WRKY 基因家族的进化，及其在非生物胁迫响应中的关键作用提供了依据，在后续研究中可以通过遗传转化、染色质免疫沉淀、酵母双杂交和酵母单杂交等手段，进一步研究HtWRKYs基因的功能和机制。
在转录组数据中鉴定出74 个WRKY 基因，其长度为510-2 040 bp，Motif 基序为25-50 个碱基，大部分HtWRKY基因与其他WRKY 基因聚合为一类。HtWRKY基因在花瓣和块茎中相对表达量较高，分别有20 个和19 个HtWRKY基因在菊芋干旱诱导表达分析的叶片和根中呈现诱导后表达量上升的趋势，HtWRKY参与了抵御干旱胁迫的过程。
文章所有附表数据请到本刊官网下载（http://biotech.aiijournal.com/CN/1002-5464/home.shtml）。
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