王雅玲 徐静 赵鹏 孙伟红 彭达 马学真
(青岛大学第二临床医学院，山东 青岛 266042 1 肿瘤中心；
2 病理科；
3 生物治疗中心)
肺癌的发病率和死亡率在全世界恶性肿瘤中居首位[1]。根据病理特征肺癌可分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌(NSCLC)，其中NSCLC约占所有肺癌的85%，主要包括肺腺癌、肺鳞癌和大细胞未分化癌3种类型，肺腺癌是NSCLC最常见的亚型[2]。肺腺癌患者术后易复发和转移，预后差[3]。P21活化激酶5(PAK5)是P21活化激酶(PAKs)家族最新发现的成员，主要定位于细胞线粒体内，位于20p12染色体上，编码相对分子质量80 000蛋白质[4]。研究发现PAK5在卵巢癌、骨肉瘤、结肠癌、乳腺癌等多种肿瘤中均呈高表达，具有潜在的促癌作用[5-8]。E-钙黏蛋白(E-cadherin)是位于细胞膜的跨膜糖蛋白，由16q22.1号染色体上的CDH1基因编码[9]。研究显示E-cadherin表达降低可导致细胞间的黏附能力减弱以及肿瘤细胞的运动能力增强，从而导致肿瘤细胞容易脱离、侵袭和转移[10]。PAK5可通过调控E-cadherin的表达水平参与多种肿瘤的发生、发展过程[11-13]。目前关于PAK5在肺腺癌中的表达情况及PAK5与E-cadherin的相关性研究尚未见报道。本研究通过免疫组织化学(IHC)方法检测肺腺癌组织中PAK5以及E-cadherin的表达情况，并对PAK5与E-cadherin表达的相关性及两者与临床病理特征的关系进行分析，旨在探讨PAK5和E-cadherin表达与肺腺癌患者预后的关系，为肺腺癌的治疗及预后评估提供新思路或参考。
1.1 一般资料
选取青岛大学第二临床医学院2014年1月—2015年12月确诊为肺腺癌的患者61例，所有患者临床资料完整，术前未行放化疗及其他抗肿瘤治疗。男27例，女34例；
年龄≤60岁者26例，>60岁者35例；
吸烟者19例，未吸烟者42例；
有淋巴结转移者22例，无转移者39例；
按照国际抗癌联盟第8版TNM分期标准，Ⅰ～Ⅱ期37例，Ⅲ期24例；
T1～T2期44例，T3～T4期17例。所有患者均行根治性手术，术后治疗方式相同，均为1个月内开始常规化疗，一个化疗周期21 d，化疗方案为培美曲塞+奈达铂，共化疗4个周期，均未接受放疗、抗血管生成及靶向药物等治疗。随访时间截至2019年4月1日，记录所有患者的总生存期(OS)和无进展生存期(PFS)，OS为从手术日至与肺癌相关死亡日或随访结束日或最后一次随访日之间的时间，PFS是从手术日到肿瘤进展的时间，若没有进展，则终点是死亡日或最后一次随访日。本研究通过了青岛大学第二临床医学院伦理委员会的审批。
1.2 IHC染色检测PAK5和E-cadherin的表达
所有患者于手术过程中留取肺腺癌组织标本，并经病理学检查确诊为肺腺癌。标本应用40 g/L甲醛溶液固定，石蜡包埋，4 μm厚连续切片。采用SP-9000法进行IHC染色检测PAK5和E-cadherin的表达，操作严格按检测试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)说明书要求进行。兔抗人PAK5多克隆抗体(ab110069，1∶100稀释)购自英国Abcam公司，兔抗人E-cadherin单克隆抗体(3195s，1∶600稀释)购自美国CST公司。
1.3 结果判读
由两位病理学专家利用光学显微镜(BX-51，日本Olympus公司)对标本染色结果进行盲评，并取平均值作为最后得分。每个切片随机选择5个高倍镜视野(200倍)，根据染色强度和阳性细胞百分比综合评分进行结果判读。以肿瘤细胞的细胞质和(或)细胞核内出现棕黄色颗粒为PAK5染色阳性，以肿瘤细胞膜出现棕黄色颗粒为E-cadherin染色阳性。染色强度评分：无染色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3 分；
同时阳性细胞百分比评分：0～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，76%～100%为4分，综合得分计算方法为：综合得分=染色强度评分×阳性细胞百分比评分。PAK5表达综合得分≥6分为高表达，<6分则为低表达[12]。E-cadherin表达综合得分>4分为高表达，≤4分则为低表达[14]。
1.4 统计学处理
采用SPSS 21.0版软件对结果进行统计学处理。采用χ2检验、Fisher精确检验及Spearman相关性分析进行统计处理；
应用Kaplan-Meier生存曲线和Log-Rank检验进行生存分析，以P<0.05为差异具有统计学意义。
2.1 肺腺癌组织中PAK5和E-cadherin的表达水平与患者临床病理特征间的关系
PAK5阳性颗粒定位于肺腺癌细胞质和(或)细胞核，呈淡黄色或棕黄色；
E-cadherin阳性颗粒定位于肺腺癌细胞膜，呈淡黄色或棕黄色(图1)。61例肺腺癌组织标本中PAK5高表达者38例(62.3%)，E-cadherin高表达者43例(70.5%)；
PAK5以及E-cadherin的表达水平均与肿瘤T分期、有无淋巴结转移和TNM分期有关(χ2=4.037～16.108，P<0.05)，但是与患者年龄、性别及是否吸烟无关(P>0.05)。见表1。
表1 PAK5和E-cadherin表达与患者临床病理特征的关系
A:肺腺癌组织中PAK5高表达；
B:肺腺癌组织中PAK5低表达；
C:肺腺癌组织中E-cadherin高表达；
D:肺腺癌组织中E-cadherin低表达。IHC染色，200倍
2.2 PAK5与E-cadherin表达与患者预后的关系
患者的随访时间为10～64个月，Kaplan-Meier生存曲线分析显示PAK5高表达及低表达患者3年总生存率分别为71.0%、95.7%，3年无进展生存率分别为67.7%、82.6%；
E-cadherin高表达及低表达患者3年总生存率分别为86.0%、67.0%，3年无进展生存率分别为81.4%、52.7%；
Log-Rank检验显示，PAK5低表达患者3年总生存率以及3年无进展生存率均大于高表达患者，差异具有统计学意义(χ2=5.893、3.920,P<0.05)；
E-cadherin高表达患者3年总生存率以及3年无进展生存率均大于低表达者，差异均具有统计学意义(χ2=5.849、7.363,P<0.05)。见图2。
A、B分别为PAK5表达高低与患者总生存率及无进展生存率的关系，C、D分别为E-cadherin表达高低与患者总生存率及无进展生存率的关系
2.3 肺腺癌组织中PAK5与E-cadherin表达水平的相关性
本研究的分析结果显示，肺腺癌组织中PAK5与E-cadherin表达水平呈负相关(r=-0.355，P<0.05)。见表2。
表2 肺腺癌组织中PAK5与E-cadherin表达水平的相关性(例)
近年来，随着分子靶向药物在肺腺癌中的广泛应用，肺腺癌的治疗取得了实质性进展，但由于目前的早期诊断方法缺乏特异度和灵敏度，肺腺癌患者确诊时大多已为晚期，5年存活率很低[15]。PAKs家族属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶类，同时也是与细胞分裂周期蛋白42(Cdc42)/Ras相关的C3肉毒素底物(Rac)的下游效应分子[16]。PAKs根据结构特点被分为两类，第Ⅰ类包括PAK1、PAK2、PAK3，第Ⅱ类包括PAK4、PAK5、PAK6，均具有激酶结构域和Cdc42/Rac结合域[17]。PAK5最初发现于神经组织中[18]，在小脑、大脑皮质以及嗅球组织中均呈高表达[19]。随着研究的深入，发现PAK5在多种恶性肿瘤中高表达，且与骨肉瘤、卵巢癌、宫颈癌以及胃癌等恶性肿瘤远处转移和预后不良密切相关[6,11-12,20]。PAK5是多种信号通路的核心分子，参与调节细胞骨架、细胞凋亡、细胞增殖、迁移和侵袭等细胞生物学行为[21]。PAK5的激酶结构域与第Ⅱ类中其他PAKs的激酶结构域相似，与PAK6有至少80%的同源性，与PAK4有85%的同源性，但是与第Ⅰ类中的PAKs仅仅有约52%～57%的同源性[19,22]。CAI等[23]研究显示，PAK4的高表达与NSCLC患者预后不良有关系。RAJA等[24]研究认为PAK6是一种有前途的新型NSCLC治疗靶点。FAWDAR等[25]发现PAK5在5%～10%的肺癌中发生了突变，并且通过MEK/ERK信号通路调节细胞的增殖与凋亡。HAN等[26]发现PAK5在骨肉瘤中高表达，可以作为骨肉瘤肺转移的预测指标。上述研究表明PAK5可能在肺癌的发生、发展中具有一定的作用。本研究结果显示，有38例(62.3%)肺腺癌组织PAK5高表达，与先前的研究结果基本一致[12,26]；
同时PAK5表达水平与肿瘤T分期、有无淋巴结转移、TNM分期密切相关，T3～T4期、有淋巴结转移、TNM分期Ⅲ期的患者中PAK5高表达率显著高于T1～T2期、无淋巴结转移、TNM分期Ⅰ～Ⅱ期的患者，表明PAK5高表达可能促进肺腺癌的浸润和转移。另外本研究中，PAK5低表达患者3年总生存率和3年无进展生存率均显著高于高表达患者，表明PAK5高表达与肺腺癌患者预后不良有关，也与先前研究结果基本一致。因此PAK5高表达在肺腺癌中可能起促癌作用，PAK5有望成为肺腺癌治疗的潜在靶点。
上皮-间质转化(EMT)是指上皮细胞失去极性，成为具有浸润能力和游走迁移能力的间质细胞的过程，EMT会促进包括肺癌在内的恶性肿瘤的转移、复发及化疗耐药，E-cadherin是维持上皮细胞极性及细胞间黏附连接的主要分子，在EMT中表达下调[27]。既往研究发现PAK5会促进宫颈癌、卵巢癌和结肠癌细胞发生EMT[11-13]，E-cadherin的表达水平与肺腺癌分化程度、是否淋巴结转移密切相关[28]。本研究结果显示，有43例(70.5%)肺腺癌组织E-cadherin高表达，在T3～T4期、有淋巴结转移、Ⅲ期的患者中E-cadherin高表达率显著低于T1～T2期、无淋巴结转移、Ⅰ～Ⅱ期的患者，考虑可能与E-cadherin表达降低使癌细胞间的黏附能力减弱有关，从而引起肺腺癌的浸润和转移。本研究还显示E-cadherin低表达与肺腺癌患者的不良预后密切相关，这与既往的研究结果基本一致[29]。PAK5与E-cadherin的表达水平呈显著负相关，提示PAK5高表达可能也与肺腺癌的EMT有关，并间接影响肺腺癌的发生、发展和预后。
总之，PAK5高表达和E-cadherin低表达与肺腺癌的浸润、转移及预后不良有关，且PAK5可能是通过调控EMT促进肺腺癌的进展。未来应进一步探讨PAK5和E-cadherin在肺腺癌发生发展中的作用机制，为肺腺癌的防治提供新思路。
利益冲突声明：所有作者声明不存在利益冲突。
ConflictsofInterest：All authors disclose no relevant conflicts of interest.
作者贡献：所有作者共同参与了论文的研究设计、写作和修改。所有作者均阅读并同意发表该论文。
Contributions：All the authors have participated in the research design, writing and revision of the manuscript.All the authors have read the last version of the paper and consented submission.
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