李 轩，谢 春，周 藜，汪淑颖，向婧姝，黄靖宇，王翠桑，向 红
(1.贵州省疾病预防控制中心，贵州 贵阳 550004 ；
2.贵州医科大学公共卫生与健康学院 环境污染与疾病监控教育部重点实验室，贵州 贵阳 550025)
弯曲菌(Campylobacterspp.)是一种革兰阴性微需氧菌，是重要的人兽共患病原菌之一，该菌可长期存活于禽类肠道并持续向外排菌。抗菌药在畜牧业中的大量使用甚至是滥用对包括弯曲菌在内的病原菌产生了选择性压力，将促使“超级细菌”出现，影响抗菌药治疗的有效性。目前耐药弯曲菌已被世界卫生组织(WHO)指定为开发新抗菌药疗法的高度优先病原体之一[1,2]。毒力和耐药性可能不是相互独立的特性，抗菌药的使用不仅会导致病原菌耐药性增强，同时与毒力因子存在正向或负向关联[2]，鲜有研究分析弯曲菌毒力因子与耐药性间是否具有相关性。抗菌药耐药性的存在和毒力因子对疾病的发展都很重要，需要进一步研究毒力因子与抗菌药耐药性之间的相互作用，以便更好地了解弯曲菌致病的本质。
本研究以贵州省9个市(州)的鸡源弯曲菌分离株为研究对象，调查毒力基因携带和耐药现状，对比分析耐药株与敏感株在统计学上携带毒力基因的差异，评估耐药表型与毒力基因相关性，以期为弯曲菌致病机制的研究提供参考。
1.1 菌株来源 在贵州省9个市(州)中随机抽取养鸡场，共采集新鲜的鸡粪便样本220份，放入Cary-Blair运送培养基中，4 ℃条件下送至实验室；
采用双孔板驱动增强法[3]分离培养弯曲菌，经生化和生物质谱检测系统鉴定后，共获得96株弯曲菌分离菌株。
1.2 主要仪器 全自动快速生物质谱检测系统(Microflex LT/SH MALDI-MS System)，布鲁克(北京)科技有限公司产品；
T100梯度PCR扩增仪、PowerPac Basic电泳仪、Gel Doc XR+凝胶成像系统，均为美国Bio-Rad公司产品。
1.3 主要试剂 弯曲菌培养检测试剂盒(ZC-CAMPY-001)、弯曲菌琼脂稀释法抗菌药最低抑菌浓度(Minimum inhibitory concentration,MIC)检测试剂盒(ZC-AST-001)、弯曲菌生化检测试剂盒(ZC-CAMPY-010)，均购自青岛中创汇科生物科技有限公司；
PremixTaq(TaKaRa Taq Version 2.0 plus dye)，购自宝生物工程(大连)有限公司。
1.4 毒力基因检测 参照参考文献[4]设计flaA、ciaB、virB11、cdtA、cdtC、wlaN、fur、katA、cadF、cheY、cdtB、sodB共12个毒力基因引物，引物由宝生物工程(大连)有限公司合成，引物序列见表1。cadF和cheY、cdtB和sodB两组的双重PCR反应体系及其余8个毒力基因的PCR反应体系：2×PremixTaq12.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1.0 μL，DNA模板1.0 μL，无菌ddH2O补足至25.0 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min；
95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30个循环；
最后72 ℃延伸5 min。取1 μL扩增产物加样于1.0% 琼脂糖凝胶中，120 V电压下电泳20 min，通过凝胶成像系统成像。
表1 毒力基因引物信息
1.5 药敏试验 参照美国临床实验室标准化研究所(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)推荐的琼脂稀释法(Agar dilution method)，使用弯曲菌琼脂稀释法抗菌药最低抑菌浓度(MIC)检测试剂盒进行药敏试验，抗菌药物包含7类11种，以空肠弯曲菌(ATCC33560)和结肠弯曲菌(ATCC43478)作为质控菌株。42 ℃微需氧培养24 h后读取MIC值。若数量较多的菌株分布在MIC范围的低值区，则耐药率低；
若数量较多的菌株分布在MIC范围的高值区，则耐药率高；
但具体判断某株菌的耐药情况是依据在MIC范围内的耐药折点值。红霉素、环丙沙星、四环素的敏感性判定依据CLSI M45-3rd版[5]，而其余抗菌药的敏感性判定依据美国国家耐药性监测系统(National Antimicrobial Resistance Monitoring System,NARMS) (https://www. cdc. gov/narms/antibiotics-tested.html)和欧洲药敏试验委员会(European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing,EUCAST)[6]的推荐标准。空肠弯曲菌对各抗菌药耐药折点值：红霉素(≥32 mg/L)、萘啶酸(≥32 mg/L)、氯霉素(≥32 mg/L)、链霉素(≥16 mg/L)、四环素(≥16 mg/L)、泰利霉素(≥8 mg/L)、氟苯尼考(≥8 mg/L)、环丙沙星(≥4 mg/L)、庆大霉素(≥4 mg/L)、克林霉素(≥1 mg/L)、阿奇霉素(≥0.5 mg/L)，结肠弯曲菌对抗菌药耐药折点值除阿奇霉素(≥1 mg/L)和克林霉素(≥2 mg/L)外，其他与空肠弯曲菌相同。
1.6 统计学分析 运用SPSS 22.0软件进行统计学分析，组间比较采用χ2检验，P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。通过计算Cramer"s V系数分析各种抗菌药耐药性与毒力基因的关系，该系数的取值范围为0～1，越接近1表示相关性越强，Cramer"s V系数<0.3表示相关性较弱，0.3≤Cramer"s V系数≤0.6表示中度相关，Cramer"s V系数>0.6表示相关性较强。
2.1 毒力基因检测 通过PCR方法检测96株弯曲菌分离株(空肠弯曲菌34株、结肠弯曲菌62株)中12个毒力基因的携带情况，结果显示，弯曲菌中sodB基因的携带率最高(99.0%)；
其次是cheY、fur，携带率均为96.9%；
cadF基因的携带率为89.6%；
virB11和ciaB的携带率均为0。cdtA、cdtB、cdtC在空肠弯曲菌中的检出率极显著高于在结肠弯曲菌中的检出率(χ2=32.500，χ2=35.855，χ2=24.525，P<0.01)，katA在结肠弯曲菌中的检出率显著高于在空肠弯曲菌中的检出率(χ2=7.521，P<0.05)(图1，表2)。
图1 弯曲菌分离株毒力基因的PCR扩增
表2 毒力基因在弯曲菌中的分布
续表
2.2 毒力基因谱分析 将96株弯曲菌分离株的毒力基因携带情况构建毒力基因谱，其中空肠弯曲菌分离株共15个谱型，结肠弯曲菌分离株共18个谱型；
空肠弯曲菌优势毒力基因谱为flaA-cadF-cheY-cdtA-cdtB-cdtC-fur-katA-sodB(20.6%)，结肠弯曲菌优势毒力基因谱为flaA-cadF-cheY-fur-katA-sodB(37.1%)；
同时携带6种及以上毒力基因的弯曲菌占76.04%，其中空肠弯曲菌占31.3%(30株)，结肠弯曲菌占44.8%(43株)(表3)。
表3 弯曲菌分离株毒力基因谱及其所占比例
续表
2.3 耐药分析 利用琼脂稀释法进行药敏试验，96株弯曲菌分离株对11种抗菌药存在不同程度的耐药。对萘啶酸耐药率最高(91.6%)，其次为四环素(88.5%)、环丙沙星(82.2%)；
对氟苯尼考最敏感(3.1%)；
空肠弯曲菌和结肠弯曲菌在耐药水平和MIC分布上存在差异，其中空肠弯曲菌对萘啶酸(88.2%)的耐药率最高，其次为四环素(85.2%)、环丙沙星(73.5%)；
结肠弯曲菌对萘啶酸(93.5%)、四环素(90.3%)、环丙沙星(87.0%)的耐药率较高；
结肠弯曲菌在红霉素、阿奇霉素、链霉素、氯霉素、泰利霉素和克林霉素中的MIC50、MIC90值均高于空肠弯曲菌(表4)。结肠弯曲菌分离株对红霉素(χ2=9.702，P<0.05)、阿奇霉素(χ2=14.877，P<0.05)、庆大霉素(χ2=8.104，P<0.05)、链霉素(χ2=11.021，P<0.05)、泰利霉素(χ2=11.671，P<0.05)和克林霉素(χ2=6.001，P<0.05)的耐药率显著高于空肠弯曲菌，其他抗菌药(萘啶酸、环丙沙星、氯霉素、氟苯尼考、四环素)在空肠弯曲菌和结肠弯曲菌间无统计学差异(P>0.05)。
表4 96株弯曲菌对11种抗菌药的体外抗菌活性比较
续表
2.4 毒力基因与耐药表型的相关性 通过计算Cramer"s V值分析弯曲菌耐药性与毒力基因的相关性，发现红霉素与cdtC基因(0.252)，阿奇霉素与cdtA(0.242)、cdtB基因(0.218)，环丙沙星与cdtB(0.272)、cdtC(0.373)、wlaN基因(0.409)，链霉素与cdtA(0.295)、cdtB(0.284)、cdtC(0.298)、wlaN基因(0.215)，氯霉素与flaA基因(0.204)，四环素与fur基因(0.427)存在弱相关；
未发现其他抗菌药耐药性与毒力基因存在关联(表5)。
表5 鸡源弯曲菌分离株耐药性与毒力基因的相关性
本试验中鸡源弯曲菌分离株编码细胞致死性膨胀毒素的cdtA、cdtB、cdtC基因检出率在40%以上，低于国内外研究结果[7,8]，这3个相邻基因在空肠弯曲菌中的检出率均显著高于结肠弯曲菌，与Bardoň等[9]的研究一致，该差异是否与空肠弯曲菌较强的致病性相关还需进一步研究。编码鞭毛蛋白的flaA基因在弯曲菌的定殖中起重要作用，虽然该基因被认为是一个保守基因，但并非在所有菌株中都可检出[10]。本试验分离株的flaA携带率为61.5%，低于Nguyen等[11]和Frazão等[12]的报道；
影响细菌粘附和定殖的质粒基因virB11检出率为0，与Wieczorek等[13]研究结果一致；
编码侵入抗原蛋白的ciaB检出率为0，与翟海华等[14]报道中的高检出率相反；
wlaN基因编码β-1,3-半乳糖转移酶，与格林巴利综合征的发生密切相关[15]，该基因检出率为13.5%，与Wieczorek等[13]的结果相近，但空肠弯曲菌和结肠弯曲菌中wlaN检出率无显著差异，与唐梦君等[8]研究结果不同；
其余5种毒力基因在分离株中有较高的检出率，与相关研究结果一致[16，17]。本试验分析发现，结肠弯曲菌毒力谱型多于空肠弯曲菌，同时携带6种及以上毒力基因的结肠弯曲菌数多于空肠弯曲菌，但空肠弯曲菌的优势谱所含毒力基因类型多于结肠弯曲菌，不可忽视结肠弯曲菌引起疾病的能力。
由于中国、南非等国家弯曲菌分离株对大环内酯类药物耐药性的上升，引起了人们将大环内酯类抗菌药作为一线治疗药物的担忧[18,19]，而本试验分离株对大环内酯类抗菌药耐药率低于40%；
与空肠弯曲菌相比，结肠弯曲菌对大环内酯类药物的耐药率较高，与上海[20]、徐州[21]的研究一致。对氟喹诺酮类药物的耐药现状同样不容忽视，本试验中弯曲菌对萘啶酸和环丙沙星的耐药率高达80%以上，与突尼斯北部[22]、意大利[23]的研究结果一致，但低于对我国5个省市鸡源弯曲菌的耐药率结果，不同地区研究结果间的差异可能与当地家禽养殖过程中所施用抗菌药的情况有关[24]。当前严重的耐药情况可能与弯曲菌对氟喹诺酮类药物的耐药机制有关，研究发现，在家禽养殖中未使用氟喹诺酮类抗菌药时耐药菌株可能仍存在，甚至耐药率可增至15%[25]。此外，本试验根据抗菌药抑菌浓度结果发现，结肠弯曲菌对抗菌药的耐药性高于空肠弯曲菌。结合结肠弯曲菌具备严重多重耐药的现状，需重视该菌种所引起弯曲菌病可能带来的额外风险。
目前，尽管弯曲菌的致病机制尚不清楚，但毒力与临床感染可能具有相关性，毒力因子也可能与耐药性有关[26]。Almofti等[27]通过体外诱变试验发现，与红霉素敏感株相比，耐药株对肠上皮细胞和小鼠巨噬细胞的粘附、侵袭性明显降低。由于多种毒力基因在感染机体导致疾病过程中参与表达毒力因子并发挥作用，但关注毒力基因与耐药性之间相互影响的研究较少。本试验从与致病相关的毒力基因角度初步分析了耐药性与毒力基因的关系，结果显示，抗菌药耐药性与部分毒力基因的存在有较弱的相关性，这与Raeisi等[28]的研究结果相似；
而ciaB毒力基因与环丙沙星、红霉素耐药性表达存在相互影响[29]，但未发现ciaB毒力基因与其耐药性有显著的相关性。因此，毒力基因与耐药性的关联性需要在分子水平上进一步研究。
综上所述，本试验发现贵州省鸡源弯曲菌分离株毒力基因普遍存在，菌株耐药情况严重，部分毒力基因与耐药性之间存在弱相关，这可为评估与控制病原弯曲菌引起的风险提供参考依据。下一步可应用全基因组分析、构建基因突变体、蛋白互相作用等分子生物学技术深入阐明毒力基因与耐药性关联的内在规律，以预防和控制弯曲菌感染。
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