朱发伟，叶 合，楼招欢，李 静，韩丽萍，黄建波，邓张亦婷，吴瑾瑾
1.台州市立医院药剂科（浙江 台州 318000）；
2.浙江医院药剂科（浙江 杭州 310013）；
3.浙江中医药大学药学院（浙江 杭州 311402）；
4.浙江中医药大学基础医学院（浙江 杭州 310053）
心脑血管疾病是当前威胁人类健康最严重的疾病之一，其发病率和病死率不断增高。以高脂血症（hyperlipidaemia，HLP）为代表的脂质代谢异常是心脑血管疾病的独立危险因素。近年来，随着人们生活水平的提高和饮食结构的改变，HLP的患病率呈逐年递增趋势，已成为全球性公共卫生事件之一［1］。据其临床表现、体征和舌脉等特点，本病可归属于中医学“痰浊”“湿热”范畴，《黄帝内经》的“膏脂学说”是其理论依据，若膏脂输化障碍，生成过剩，膏脂内蓄则易形成病理性脂浊［2］。膏脂的输化障碍主要责之于脾、肝、肾三脏，因脾失健运、肝失疏泄、肾失气化而发病，其中脾脏最为关键［3］。脾是水液代谢的枢纽，具有调节津液输布和水液代谢的功能。现代研究［4-5］发现，广布于人体泌尿、消化、呼吸系统的水通道蛋白（AQPs）在人体水液转运和代谢中起关键作用，脾主运化水津功能与AQPs的表达呈正相关，调节AQPs的表达有助于促进水液和脂质的转运和代谢，减少“痰湿”和“脂浊”的形成，进而阻断高脂血症的发生发展。
现有研究［6］表明，中医药在调节血脂、防治高脂血症及相关疾病方面具有独特的优势和巨大的应用前景。荷叶（Nelumbinis Folium）为睡莲科莲属多年生草本挺水植物莲荷的叶，其味苦，归肝、脾、胃经，可清暑化湿，改善高脂血症“痰湿”状态，恢复脾的运化功能，阻断脂浊的形成和发展，是湿热蕴结型高脂血症的常用中药之一［7］。有研究［8］报道，荷叶水提物（LLE）能显著降低昆明小鼠的三酰甘油（TG）水平。本课题组研究［9-10］发现，荷叶具有通过改善脂质代谢拮抗非酒精性脂肪肝的作用，并可有效保护肝脏免受脂质浸润。本研究旨在进一步观察LLE对高脂饮食诱导的HLP大鼠模型TG以及AQPs的影响，阐释荷叶升清降浊祛湿改善“痰湿”、防治高脂血症的现代科学内涵，以期拓展荷叶的临床应用，为心脑血管疾病的防治提供新思路，促进相关产品研发。
1.1 材料
1.1.1 动物 雄性SD大鼠，28只，体质量（250±20）g，由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供。动物生产许可证号：SCXK（浙）2018-0006。动物饲养于浙江中医药大学实验动物中心。按照实验动物管理条例，于室温（23±2）℃、相对湿度45%～55%条件下饲养；
人工光照，明、暗各12 h，自由进食饮水。动物于实验前适应性喂养7 d。本动物实验方案经浙江中医药大学动物管理与伦理委员会批准（伦理批准号：IACUC-20210726-07）。
1.1.2 药物与试剂 荷叶饮片（Nelumbinis Folium），由浙江中医药大学中药饮片有限公司提供（批号：210401），浙江中医药大学陈孔荣副教授鉴定为莲Nelumbo nucifera Gaertn.的干燥叶。LLE：取适量荷叶药材，加相当于药材质量10倍的水，100 ℃回流提取1 h，重复两次，过滤，合并滤液，减压浓缩至1 g/mL，4 ℃贮存备用。
依折麦布片（Ezetimibe，10 mg/片），杭州默沙东制药有限公司生产（批号：J20171023），临用前用纯水配制成0.1 g/L的混悬液。
TG试剂盒，宁波美康生物科技有限公司（批号：190419101）；
胃泌素（GAS）、胃动素（MTL）试剂盒，江苏科特生物科技有限公司（批号：09112784R、09112791R）。TRIzol试剂，美国Invitrogen公司（批号：15596018）；
AQP3、AQP8、AQP9，美国Gene Tex公司（批号：GTX64481、GTX47929、GTX37783）；
甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH），华安生物技术有限公司（批号：HG0718）。
高脂饲料，购自南通特洛菲饲料科技有限公司。
1.1.3 仪器 全自动生化分析仪，日本Sysmex株式会社（型号：日立3100）；
超微量核酸蛋白测定仪，德国耶拿公司（型号：scandrop100）；
荧光定量PCR仪，德国耶拿公司（型号：qTOWER2.2）；
高速冷冻离心机，美国Thermo Fisher Scientific公司（型号：Biofuge Stratos）。
1.2 分组与造模 SD大鼠常规饲养7 d后，称定体质量，大鼠随机分4组，即正常组、模型组、依折麦布组、荷叶组，每组7只。除正常组外，其余各组给予高脂饲料，建立高脂血症动物模型［11-12］。
1.3 干预 依折麦布按人推荐日用量10 mg/d等效剂量换算；
荷叶按《中华人民共和国药典（2020年版）》［13］用量为3～10 g，结合前期实验取10 g/d等效剂量换算。在造模的同时给药，正常组和模型组大鼠按10 mL/kg体质量灌胃纯水，其余两组分别灌胃给予1.0×10-3g/kg依折麦布水溶液及1.0 g/kg 的LLE，每日1次，连续6周。实验期末，心脏采血，解剖，分取结肠组织备用。
1.4 检测指标与方法
1.4.1 血清TG水平 给药6周后眼眶后静脉丛采血约1 mL，置于1.5 mL离心管中，采血前禁食不禁水12 h。静置1 h，4 ℃下，3 000 r/min，离心10 min，取上清液即血清。全自动生化分析仪检测大鼠血清血脂TG水平。
1.4.2 血清GAS、MTL水平 给药6周后眼眶后静脉丛采血约1 mL，置于1.5 mL离心管中，4 ℃ 5 000 r/min，离心15 min，取上清液。ELISA法检测各样本中GAS、MTL水平。
1.4.3 结肠中Na+-K+-ATP酶含量 给药6周后，取适量结肠组织，置于预冷冻存管内，加入无水乙醇，冰浴上匀浆1 min，转移置预冷EP管中。4 ℃ 5 000 r/min离心15 min，取上清液。ELISA法检测各样本中Na+-K+-ATP酶含量。
1.4.4 结肠组织AQP3、AQP8、AQP9 mRNA表达水平采用RT-qPCR法检测结肠组织AQP3、AQP8、AQP9 mRNA表达水平。取-80 ℃冻存的大鼠结肠组织，以TRIzol试剂提取结肠组织总RNA，逆转录反应体系为20 μL，根据试剂说明书操作，按条件进行逆转录，反应条件40 ℃，30～60 min；
95 ℃，5 min。扩增引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列见表1。PCR 反应条件：95 ℃、5 min，95 ℃、15 s，60 ℃、30 s，40个循环。采用Melt曲线分析，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）的表达为内参。每个样品重复3次，扩增结束，记录Ct值，按照2-ΔΔCt公式计算目的基因mRNA的相对表达量。
表1 引物序列
1.4.5 肝组织病理学及脂质沉积情况观察 取各组大鼠肝脏左叶相同部位，部分置于液氮中，固定，冷冻切片机切片，油红O染色后封片。部分肝脏置于4%多聚甲醛中固定，梯度乙醇脱水，石蜡包埋，切片，HE染色，光镜下观察肝脏脂质沉积情况。
1.5 统计学方法 实验数据采用SPSS 17.0统计软件分析。计量资料以±s表示，多重比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），组间比较方差齐性用LSD方法检验，方差不齐用Dunnett检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
2.1 对HLP模型大鼠血清TG的影响 与正常组比较，模型组SD大鼠血清TG水平升高，但差异无统计学意义（P>0.05）。与模型组比较，依折麦布组、荷叶组能够降低SD大鼠血清TG水平，但各组间差异无统计学意义（P>0.05）。荷叶组降低TG水平的作用与依折麦布组相当，两组间差异无统计学意义（P>0.05）。见图1。
图1 各组大鼠血清TG水平比较
2.2 对HLP模型大鼠血清GAS、MTL水平的影响 与正常组比较，模型组大鼠血清GAS水平降低（P<0.05），MTL水平升高（P<0.05）。与模型组比较，荷叶组、依折麦布组能升高GAS水平（P<0.05），且能降低MTL水平（P<0.05）。与依折麦布组比较，荷叶组GAS相对较高，MTL水平相对较低，但差异无统计学意义（P>0.05）。见图2。
图2 各组大鼠血清GAS、MTL水平比较
2.3 对HLP模型大鼠Na+-K+-ATP酶含量的影响 与正常组比较，模型组大鼠Na+-K+-ATP酶含量降低（P<0.05）。与模型组比较，荷叶组、依折麦布组Na+-K+-ATP酶含量升高（P<0.05）。与依折麦布组比较，荷叶组Na+-K+-ATP酶含量相对较高，但差异无统计学意义（P>0.05）。见图3。
图3 各组大鼠Na+⁃K+⁃ATP酶含量比较
2.4 对HLP模型大鼠结肠组织AQP3、AQP8、AQP9 mRNA表达的影响 与正常组比较，模型组大鼠结肠组织AQP8、AQP9 mRNA表达增加（P<0.05），AQP3 mRNA表达水平有增加趋势，但差异无统计学意义（P>0.05）。与模型组比较，荷叶组、依折麦布组大鼠结肠组织AQP8、AQP9 mRNA表达显著减少（P<0.05），AQP3 mRNA表达水平有降低趋势，但差异无统计学意义（P>0.05）。与依折麦布组比较，荷叶组AQP3、AQP8 mRNA表达相对较高（P<0.05）。见图4。
图4 各组大鼠AQP3、AQP8、AQP9 mRNA表达情况比较
2.5 对HLP模型大鼠肝脏脂质沉积的影响 肝脏组织HE染色结果显示：正常组大鼠肝细胞形态正常，以中央静脉为中心呈放射状排列；
模型组大鼠肝脏中央静脉周围细胞呈空泡性改变，伴较多炎症细胞浸润；
依折麦布组空泡样变性及炎性浸润较少；
荷叶组大鼠肝细胞脂质沉积和炎性浸润有效改善。见图5-Ⅰ。
油红O染色结果：正常组大鼠肝细胞核蓝染，未见橘红色脂滴；
模型组大鼠肝细胞脂滴明显增多；
依折麦布组及荷叶组大鼠肝细胞脂滴数量较模型组明显减少。见图5-Ⅱ。
图5 各组大鼠肝组织病理情况
本实验采用高脂饲料饲养复制HLP大鼠模型，在实验周期末，模型组大鼠血清TG水平明显高于正常组，提示模型大鼠存在血脂代谢异常现象；
予以荷叶提取物干预后，模型大鼠血清TG水平降低，表明荷叶对高脂饮食诱导的高脂血症具有一定的改善作用，该作用与依折麦布相当。
高脂血症在中医学中归属于“痰浊”的范畴。痰是人体水液代谢紊乱所形成的病理产物。《古今医鉴》言：“痰属湿，乃津液所化。”有学者认为，痰生百病，高脂血症的形成亦与痰密切相关。《明医杂著·风症》载：“故云痰遍身上下无处不到，盖即津液之在周身者。津液生于脾胃，水谷所乘，浊则为痰，故痰生于脾土也。”现代人不遵四时，食饮无度，不忌生冷、油腻之物，导致痰湿内生，中阳被遏，脾失健运，水液停聚，聚而成痰饮，痰饮积聚，体内精微物质运化失司，日久积聚脉道，遂为血浊，发为高脂血症。高脂血症外因多为饮食、六淫，病位主要在脾胃，病理产物为痰湿，临床多从痰湿论治［14-15］。《素问·至真要大论》载：“诸湿肿满，皆属于脾。”《素问·经脉别论》载：“脾气散精，上归于肺，通调水道，下输膀胱，水精四布。”上述表明脾具有调节津液输布和水液代谢的功能。
现代研究［15-16］发现，广布于人体泌尿、消化、呼吸系统的AQPs在人体水液转运和代谢中起关键作用，脾主运化水津功能与AQPs的表达呈正相关，AQPs的正常表达是保障中医脾主运化功能的前提。AQPs是一类小分子、非亲水、完整跨膜蛋白，包括AQP0-2、AQP4-6和AQP8等只渗透水的经典水通道蛋白和AQP3、AQP7、AQP9-10等转运水、甘油及尿素等小分子的水-甘油通道蛋白［4-5］。AQP4、AQP8等经典AQPs介导细胞内水分子的转运，参与肠道水液代谢，其表达异常可致肠道湿浊瘀滞，影响脾的运化功能［16］；
AQP9调节肝脏水和甘油的摄取，参与胆汁代谢及肝细胞内TG和糖原的合成［17-18］；
AQPs的异常表达可影响脂质代谢异常，介导高脂血症、脂肪肝等的形成［19］。研究［20-21］表明，下调高脂血症大鼠结肠组织中AQP3、AQP8等mRNA的表达，能有效改善结肠因过度重吸收水液导致的水液停聚，减少痰湿的生成，消除高脂血症的病因，阻断高脂血症的进一步发展。荷叶具有升清降浊、祛湿利尿功效，文献报道［8］及课题组前期研究［9］证实LLE具有调节血脂、改善脂肪肝的作用。本研究结果显示，LLE能够下调模型大鼠结肠组织AQP8、AQP9 mRNA表达，改善肝组织脂质沉积，提示LLE可能通过调节肠道AQPs表达，改善水液代谢及湿浊形成，进而阻断高脂血症的发生发展。
GAS是一种胃肠黏膜细胞分泌的胃肠激素，能促进食道括约肌收缩，抑制小肠对水、盐的吸收。MTL是消化道激素之一，可以刺激胃运动，促进胃排空。有研究［22］表明，GAS和MTL分泌异常与脾虚证关系密切，调节GAS的正常分泌可以恢复中医理论所讲的脾主运化、升清降浊的功能。血清GAS、MTL可以作为衡量健脾作用的药理指标［23］。本研究结果表明，高脂血症模型大鼠GAS、MTL水平出现异常表达，说明高脂饮食可导致大鼠脾虚。LLE干预能有效恢复上述胃肠激素水平，提示LLE具有改善模型大鼠脾虚的功能。
Na+-K+-ATP酶为镶嵌在肠道细胞质磷脂双分子层之间的一种调控Na+-K+跨膜转运的蛋白质，其在机体水液代谢、物质转运、能量转换等生理过程中发挥着重要作用。通过分解ATP获得能量转运Na+、K+，促进水液转运，维持胞内外Na+、K+浓度梯度和水液平衡。研究［24］发现，脾虚状态时，Na+-K+-ATP酶活性降低，使细胞内外水液转运失衡，导致水湿停聚，促进机体痰湿形成，进而介导高脂血症的发生发展。本实验结果显示，LLE能显著升高模型大鼠Na+-K+-ATP酶活性，改善大鼠便溏现象，提示LLE可能通过调节Na+-K+-ATP酶介导的细胞水液代谢，改善高脂血症痰湿状态。LLE对GAS等胃肠激素水平及Na+-K+-ATP含量等脾主运化相关指标的改善作用整体趋势上高于依折麦布，该作用可能为其优势特色之处。
综上，LLE可能通过调节肠道AQPs表达水平及GAS、MTL、Na+-K+-ATP酶含量，改善水液和脂质的转运和代谢，恢复高脂血症模型大鼠脾主运化功能，改善高脂血症“痰湿”状态，进而减缓高脂血症脂浊的形成和发展。
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