朱圣婴，曹嘉炜，徐进，，陈晨辉，郭清城 ，李军，张大鹏 ，，钱卫珠 ，，侯盛 ，，郭怀祖 ，
1.上海张江生物技术有限公司抗体药物与靶向治疗国家重点实验室，上海 201203；
2.国家药品监督管理局治疗类单抗质量控制重点实验室，上海 201203；
3.聊城大学药学院，山东 聊城 252059；
4.泰州迈博太科药业有限公司，江苏 泰州 225316
单克隆抗体（简称单抗）药物以其特异性高、疗效确切、半衰期长等特点，在恶性肿瘤以及自身免疫疾病治疗中占有越来越重要的地位［1］。但单抗的稳定性较差，在储存或使用过程中易发生聚集［2］，因此需在其制剂处方中加入赋形剂、表面活性剂等保护剂以抑制其聚集体的产生［3］。目前已上市的单抗药物中使用较多的表面活性剂是聚山梨酯（polysorbate，PS）20 和PS80，其主要区别在于脂肪酸侧链的结构、长度及饱和度不同导致的其与蛋白亲和力的不同［4-5］。一般认为PS20 的稳定性更好，抑制聚集体的效果更柔和［6］，PS80 的增溶性更强［7］，因此，针对不同的单抗药物，其保护效果可能呈现一定的差异性。此外，PS本身在高温或光照等恶劣条件下易被氧化形成某些过氧化物［8-9］，而这些过氧化物又会氧化单抗的某些氨基酸残基导致其稳定性下降［10］，因此，需对PS的添加量进行合理设计。针对于PS影响单抗稳定性的研究已成为热点，特别是其对于单抗制剂中不溶性微粒的形成机制研究［11-12］，但PS 种类间的对比研究仍较少，不同种类PS 对于单抗稳定性影响的差异仍不明确，因此，有必要针对性地进行相关研究，明确不同种类、不同含量PS对单抗稳定性影响的差异。
本研究以多种不同类型的单抗作为模型蛋白，分别在其制剂处方基础上添加不同种类或含量的PS，并进行各种影响因素研究，通过检测各影响因素条件下蛋白聚集体、电荷异质体和不溶性微粒等质量属性的变化，评估不同种类、不同含量的PS 对于单抗药物稳定性的影响差异，从而为PS 在单抗药物制剂处方中的研究应用奠定基础。
1.1 单抗 单抗A（mAbA，IgG1前抗体药物）、单抗B（mAbB，IgG1 单抗）和单抗 C（mAbC，IgG1 单抗，Fc N297A突变）均由上海张江生物技术有限公司研制。
1.2 主要试剂及仪器 磷酸二氢钠购自默克化工技术（上海）有限公司；
磷酸氢二钠购自成都华邑药用辅料制造有限责任公司；
氯化钠购自江苏省勤奋药业有限公司；
CX-1 pH Gradient Buffer A 和CX-1 pH Gradient Buffer B 购自美国 Thermo Fisher 公司；
PS20和PS80购自南京威尔药业集团股份有限公司；
30 KD超滤膜包和0.2 μm 针式滤器购自美国Millipore 公司；
MS3002S／01 型电子天平和 220-K-CN 型 pH 计购自美国梅特勒托利多公司；
PALL FS010K10 型台式超滤系统购自美国Pall公司；
THZ-C-1型全温振荡器购自苏州培英实验设备有限公司；
ICH 110 L 恒温培养箱和ICH 750 L 恒温培养箱购自德国美墨尔特公司；
Waters ACQUITY UPLC 高效液相色谱仪和Waters SEC 200Å色谱柱（1.7 μm，4.6 mm×150 mm）购自美国Waters公司；
Thermo MABPac SCX-10（10 μm，4 mm × 150 mm）购自美国Thermo Fisher 公司；
GWF-8JA型微粒分析仪购自天津天河分析仪器有限公司。
1.3 PS 种类对单抗稳定性影响的检测 使用30 KD超滤膜包分别将mAbA、mAbB 及mAbC 置换至各自特定的制剂处方中，并按表1 添加不同种类及指定浓度的PS 以完成不同处方条件的配制，最后使用0.2 μm 滤器对各处方条件下的样品进行过滤后分装至离心管中，并进行高温及振荡等影响因素试验，实施方式及检测方法见表2。每个条件每个取样点的样品均设3 个复孔，所有检测数据均取其平均值后绘制柱状图。
表1 mAbA、mAbB及mAbC的各处方条件Tab.1 Formulations of mAbA，mAbB and mAbC
1.4 PS 含量对单抗稳定性影响的检测 使用30 KD超滤膜包将mAbC 置换至特定的制剂处方中，加入PS20 使其终浓度分别为 0.025、0.05 及 0.5 g／L，以完成3 种处方条件的配制，最后使用0.2 μm 滤器对各处方条件下的样品过滤后分装至离心管中进行高温、光照及振荡等影响因素试验，实施方式及检测方法见表2。每个条件每个取样点的样品均设3 个复孔，所有检测数据均取其平均值后绘制柱状图。
表2 各影响因素试验及检测方法Tab.2 Test and detection methods of various influencing factors
1.5 指标检测
1.5.1 尺寸排阻色谱法（SEC-HPLC）纯度分析 色谱柱：Waters SEC 200Å column（1.7μm，4.6 mm ×150 mm）；
流动相：200 mmol／L磷酸盐缓冲液，pH 7.0；
流速：0.2 mL／min；
上样量：50 μg；
柱温：25 ℃；
样品池温度：5 ℃；
检测波长：280 nm。使用Waters ACQUITY UPLC 高效液相色谱仪对试验结果进行数据处理，用面积归一化法计算纯度。
1.5.2 离子交换色谱法（IEX-HPLC）纯度分析 色谱柱：Thermo MABPac SCX-10（10 μm，4 mm × 150 mm）；
mAbA 和 mAbB 所用流动相 A：125 mmol／L 磷酸二氢钠，流动相B：125 mmol／L磷酸氢二钠，流动相C：1 mol／L 氯化钠，流动相 D：超纯水；
mAbC 所用流动相A：CX-1 pH Gradient Buffer A，pH 5.8，流动相B：CX-1 pH Gradient Buffer B，pH 10.2；
流速：0.5 mL／min；
上样量：50 μg；
检测波长：280 nm。使用Waters ACQUITY UPLC 高效液相色谱仪对试验结果进行数据处理，用面积归一化法计算纯度。
1.5.3 不溶性微粒检测 取合并后总体积不少于25 mL的供试品，置于检测容器中，静置20 min后检测。直接将检测容器置于微粒分析仪的取样器上，开启搅拌，使溶液混匀，由仪器直接抽取适量溶液。测定4次，每次抽取量不少于5 mL。第1 次数据不计，取后续测定结果的平均值，打印原始数据。
1.6 统计学分析 采用JMP13.2.0 软件进行统计学分析，实验数据用均数±标准差表示。两组之间比较采用t检验，多组之间比较采用方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。
2.1 PS种类对单抗稳定性的影响
2.1.1 SEC-HPLC mAbA 在经历高温及振荡后，其聚集体含量呈显著上升趋势，稳定性较差，高温条件下PS80和PS20组的聚集体含量分别为0.82%和0.81%，振荡条件下聚集体含量分别为0.51%和0.50%，差异均无统计学意义（t分别为 1.512 和 0.522，P分别为 0.207 和 0.631）。相比较而言，mAbB 和 mAbC 呈现出较优的稳定性，其聚集体含量均无太大改变，且mAbB 在高温条件下PS80 及PS20 组的聚集体含量分别为0.49%和0.52%，振荡条件下的聚集体含量分别为0.48%和0.49%，差异均无统计学意义（t分别 为 -1.765 和 0.632，P分别为 0.167 和 0.567）。mAbC 在高温条件下PS80 及PS20 组的聚集体含量分别为0.83%和0.87%，振荡条件下的聚集体含量分别为0.89%和0.91%，差异均无统计学意义（t分别为-1.037 和-1.809，P分别为 0.407 和 0.150）。见图1。
图1 不同影响因素试验下各条件组SEC 聚集体的变化趋势图Fig.1 Change trend diagram of SEC aggregates in groups with various conditions in test under different influencing factors
2.1.2 IEX-HPLC 相较于振荡条件，3 种单抗对于高温条件的影响均较为敏感，3 者在经历高温后，其IEX 主峰含量均呈不同程度的递减趋势（主峰大部分转化为酸性变异体），而在经振荡后，其主峰含量均无显著变化。mAbA 在高温条件下PS80 及PS20组的主峰含量分别为12.7%和12.6%，振荡条件下的主峰含量分别为21.9%和21.7%，差异均无统计学意义（t分别为 0.265 和 1.095，P分别为 0.808 和0.344）。mAbB 在高温条件下 PS80 及 PS20 组的主峰含量分别为58.5%和58.3%，振荡条件下的主峰含量分别为73.3%和73.1%，差异均无统计学意义（t分别为 1.581 和 0.318，P分别为 0.200 和 0.767）。mAbC 在高温条件下PS80 及PS20 组的主峰含量分别为62.6%和62.7%，振荡条件下的主峰含量分别为74.0%和74.1%，差异均无统计学意义（t分别为-1.000和-1.225，P分别为0.387和0.288）。见图2。
图2 不同影响因素试验下各条件组IEX 主峰的变化趋势图Fig.2 Change trend diagram of main peak of IEX in groups with various conditions in test under different influencing factors
2.1.3 不溶性微粒 针对于mAbA，PS80 及PS20 处理的样品在振荡后其直径≥10 μm 的不溶性微粒个数分别为6.9和6.3个／mL，直径≥25 μm的不溶性微粒个数分别为1.1 和1.4 个／mL，两者差异均无统计学意义（≥ 10 μm：t=0.593，P=0.587，≥ 25 μm：t= -0.368，P= 0.733）；
针对于 mAbB，PS80 及 PS20处理的样品在振荡后其直径≥10 μm 的不溶性微粒个数分别为7.8 和11.3 个／mL，差异有统计学意义（t= -3.137，P= 0.046），直径 ≥ 25 μm 的不溶性微粒个数分别为2.4 和3.6 个／mL，差异无统计学意义（t= -1.108，P= 0.331），即PS80 对于抑制mAbB中直径≥10 μm 的不溶性微粒增加的效果更为显著；
针对于mAbC，PS80及PS20处理的样品在振荡后其直径≥10 μm 的不溶性微粒个数分别为13.7 和7.9 个／mL，直径 ≥ 25 μm 的不溶性微粒个数分别为3.3 和1.1 个／mL，两者差异均有统计学意义（≥10 μm：t=4.669，P=0.037，≥ 25 μm：t=6.128，P=0.022），即PS20 对于抑制mAbC 中不溶性微粒增加的效果更为显著。见图3。上述结果也表明，不同种类的PS 对于抑制不同类型单抗不溶性微粒增加的效果具有一定差异性。
图3 振荡试验下各条件组 ≥ 10 μm（A）和 ≥ 25 μm（B）不溶性微粒个数比较Fig.3 Comparison of number of insoluble particles ≥ 10 μm（A）and ≥ 25 μm（B）in groups with various conditions after shaking
2.2 PS含量对单抗稳定性的影响
2.2.1 SEC-HPLC 0.025、0.05 及 0.5 g／L PS20 浓度下的mAbC 在经历高温、光照及振荡后，其聚集体含量均呈上升趋势，高温后生成的聚集体含量分别为0.77%、0.76%和0.80%，三者差异无统计学意义（F= 1.444，P= 0.308）；
光照后生成的聚集体含量分别为0.79%、0.76%和0.77%，三者差异无统计学意义（F= 0.536，P= 0.611）；
振荡后生成的聚集体含量均为0.90%，三者差异无统计学意义（F=0.071，P=0.932）。见图4。表明PS20浓度在0.025 ～0.5 g／L 范围内对于抑制mAbC 聚集体生成的效果趋于一致。
图4 不同PS20浓度下mAbC的SEC聚集体变化趋势图Fig.4 Change trend diagram of aggregates of SEC of mAbC under different concentrations of PS20
2.2.2 IEX-HPLC 0.025、0.05 及 0.5 g／L PS20 浓度下的mAbC在经历振荡后，其IEX 主峰均无显著变化；
而在经历高温及光照后，3 种PS20 浓度下的样品其主峰含量均呈递减趋势（主峰大部分转化为酸性变异体）。高温后生成的主峰含量分别为60.7%、62.7%和62.4%，即0.025 g／L PS20浓度下的mAbC与0.05 及0.5 g／L PS20 组之间差异有统计学意义（t分别为15.491和13.168，P分别为0.000和0.001），0.025 g／L PS20组其主峰含量相对较低。光照后生成的主峰含量分别为53.7%、55.4%和53.7%，三者差异无统计学意义（F= 3.757，P= 0.088）；
振荡后生成的主峰含量分别为74.2%、74.0%和74.1%，三者差异无统计学意义（F=0.867，P=0.467）。见图5。表明PS20浓度在0.025 ～0.5 g／L范围内对于mAbC中电荷异质体的影响基本一致，但较低的PS20 浓度也可能会影响该单抗主峰的含量。
图5 不同PS20浓度下mAbC的IEX主峰变化趋势图Fig.5 Change trend diagram of main peak of IEX of mAbC under different concentrations of PS20
2.2.3 不溶性微粒 0.025、0.05及0.5 g／L PS20浓度下的mAbC 在经历振荡后，其直径 ≥10 μm 的不溶性微粒个数分别为 225.5、7.9 和 17.2 个／mL，0.025 g／L PS20 浓度与其他2 个浓度之间差异有统计学意义（t分别为-36.235 和-32.727，P分别为0.001和0.000）；
直径 ≥ 25 μm 的不溶性微粒个数分别为 13.7、1.1 和 7.8 个／mL，3 种浓度两两之间差异均有统计学意义（t分别为-30.660、-4.556和5.502，P分别为 0.001、0.031 和 0.031）。见图 6。mAbC 在0.025 g／L PS20 浓度下，其不溶性微粒的生成数量最多；
在PS20 浓度为0.05 g／L 时，其不溶性微粒的生成数量最少。表明0.025 g／L PS20 对于抑制不溶性微粒增加的效果有限，而随着PS20 浓度上升，其抑制效果逐渐增强，当浓度达0.5g／L 时，其作用趋于饱和。
图6 不同PS20 浓度下mAbC 中 ≥ 10 μm（A）和 ≥ 25 μm（B）不溶性微粒个数比较Fig.6 Comparison of number of insoluble particles ≥ 10 μm（A）and ≥ 25 μm（B）of mAbC under different concentrations of PS20
为探究PS 种类及含量对于不同类型单抗类药物稳定性影响的差异，本研究以对于单抗类药物具有一定代表性的几种不同类型的抗体作为模型蛋白，并在每种单抗制剂处方基础上加入不同种类或不同含量的PS 以进行相关质量参数的比较。PS 种类的研究结果显示，mAbA 相较于其他2 种单抗，对于外界影响因素的作用更为敏感，PS80或PS20 的加入并不能很好地改善其纯度大幅降低的情况，且两种PS 在抑制其聚集体及不溶性微粒形成的效果方面相似，抑制聚集体形成的程度也有限，因此，为进一步提高mAbA 的稳定性，可能还需对制剂处方中的其他辅料进行筛选优化。针对于mAbB 及mAbC，制剂处方中添加不同种类的PS 对于抑制单抗聚集体形成及维持抗体电荷异质体方面起到了一定的作用，且二者所起的作用无显著性差异，而在不溶性微粒的抑制效果方面，mAbB 在添加PS80 的处方中其不溶性微粒形成数目更少，相反mAbC 更适合添加PS20。上述研究结果也表明，针对于不同类型的单抗，PS的保护效果具有一定的相似性，但在不溶性微粒指标上呈现一定的差异，因此，在设计单抗药物的制剂处方时，可基于这些共性和差异，对PS 的种类进行筛选评估，从而挑选出最适合于该单抗的PS种类。
PS 含量研究结果显示，当PS20 浓度在0.025 ～0.5 g／L 范围内时，mAbC 在聚集体含量上的变化趋于一致，即PS20 浓度在一个较宽的范围内对抑制聚集体增加呈相似的效用。但对于mAbC 的其他特性，如电荷变异体的指标方面，PS20浓度过低将导致电荷变异体中主峰的含量下降。此外，过低的PS20浓度还将无法有效抑制制剂中不溶性微粒数目的增加，而随着PS20 浓度上升，其抑制作用也将逐步增强并最终达到饱和。该研究结果也表明，PS 含量的多少将直接影响其保护单抗的能力，过低浓度的PS其保护作用有限，而高浓度的PS 又无法进一步提升其保护性能，且会增加PS 降解后引入相关杂质从而造成蛋白免疫原性增强及稳定性降低的风险，因此，单抗的制剂处方设计中同样需关注PS的添加量。
PS 对于单抗类药物稳定性的影响，涉及到不同的层面及深度［13-15］，本研究仅针对其种类及含量进行了相关的考察和评估，旨在说明不同类型的单抗其对于不同种类、不同含量PS 的敏感度各不相同，因此在设计单抗的制剂处方时需对PS 种类及含量进行全面的筛选和比较。而随着PS 在单抗药物制剂中的应用越来越广泛，如何正确合理地选择PS 仍是未来单抗药物制剂处方开发的重要课题［16］，对于其如何影响单抗药物稳定性的机理也需进行更深入的研究。
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