李 丹 ，万绪莲 ，李律宇 ，云 宇 ，罗光云 ，刘韦兵 ，林公府 ，李 宁 ，黎勇坤 ，段为钢
（1）昆明医科大学基础医学院，云南 昆明 650500;2）云南中医药大学基础医学院，云南 昆明 650500;3）昆明市中医医院骨伤科，云南 昆明 650500;4）云南省第一人民医院骨科，云南 昆明 650100;5）广南县人民医院骨科，云南 文山 663300）
高尿酸血症是危害人类健康的“第四高”，与痛风、高血压、糖尿病等常见病关系密切[1]。高尿酸血症的有效防治已经成为临床和实验研究的热点。虽然基于正常实验动物大小鼠，采用药物或食物建立高尿酸血症的模型层出不穷[2]，但这些动物表达的尿酸酶则是贴近临床研究的障碍。近年来，尿酸酶缺失的大小鼠实验动物已经成功研制[3−4]，但尿酸酶缺失后肠道菌群会发生什么改变一直未见系统报道。考虑到肠道也是尿酸排泄的重要途径，肠道菌群可能也具有一定的贡献[5−6]。本研究以同龄野生型大鼠为对照，系统观察尿酸酶缺失大鼠（Kunming-DY，KDY 大鼠）肠道和粪便菌群变化，为进一步研究KDY 大鼠血尿酸变化与肠道菌群的关系提供实验依据。
1.1 材料
雄性尿酸酶缺失大鼠，即KDY 大鼠由课题组前期采用CRISPR/Cas9 技术研制[4]，45 d 日龄，按照SPF 标准饲养，自由进食饮水，环境温度（22±2）℃，模拟自然光照。对照鼠为雄性SPF 级SD 大鼠，45 d 日龄，由简阳达硕动物科技有限公司提供。
尿酸检测试剂盒（磷钨酸法）购自南京建成生物工程研究所，全波长酶标仪（K6600A 型）由北京凯奥科技发展有限公司生成。其他试剂或仪器也均为国产。
1.2 动物实验
随机取6 只45 d 日龄雄性KDY 大鼠为尿酸酶缺失组（Uox-/-），随机取6 只45 d 日龄SD 大鼠为对照组（WT）。日龄45 d 时，称重，收集每只大鼠的新鲜粪便。随后乌拉坦（1 g/kg）麻醉大鼠，剪开腹腔，从腹主动脉取血制备血清。其中各组取3 只大鼠肠道（十二指肠到结肠末端），摊成110 cm（其中小肠90 cm，盲肠10 cm，结肠10 cm），每5 cm 取样于试管中。用干冰保存送样到上海生工生物工程（上海）有限公司提取DNA 进行16SrDNA 测序。
1.3 尿酸测定
血尿酸按照试剂盒说明书检测。
1.4 菌群16SrDNA 高通量测序
样品中的DNA 采用E.Z.N.A™ Mag-Bind Soil DNA Kit（OMEGA）试剂盒进行提取，采用Qubit3.0 DNA 检测试剂盒（Life）对提取的样品进行精确扩增，扩增引物选择原核生物V3～V4 引物（341F：CCTACGGGNGGCWGCAG 和805R：GACTACHVG GGTATCTAATCC 进行第1 轮扩增。随后加入Illumina 桥式PCR 兼容引物进行第2 轮扩增建立DNA文库进行高通量测序[7]。测序在数据分析上：采用QIIME 进行质控过滤掉不符合要求的DNA 序列，应用UPARSE 算法一致性水平达到97%以上的序列进行OTU 聚类，用UCLUST 分类法联网与SILVA数据库注释分析，采用R 语言分析群落组成分。在原核微生物类别上根据算法依次在门、纲、目、科和属水平进行归类并进行相对丰度（%）计算。
1.5 统计学处理
2.1 大鼠血尿酸和体重变化
自由饮食状态下，正常野生型SD 大鼠的血尿酸约为11.77～14.69 µg/mL。尿酸酶缺失的KDY大鼠血尿酸水平显著升高到64.71～78.51 µg/mL之间，部分动物已经达到高尿酸血症的诊断标准（图1A）。尿酸酶缺失的KDY 大，鼠血尿酸水平显著升高，差异有统计学意义（P<0.05）。尿酸酶缺失后，比同龄雄性野生型SD 大鼠的体重明显减轻，即从250 g 减轻到170 g 左右，差异有统计学意义（P<0.05），见图1B。
图1 KDY 大鼠的血尿酸水平和体重变化[（），n=6]Fig.1 Changes of blood uric acid level and body weight in KDY rats[（），n=6]
2.2 KDY 大鼠肠道菌群变化
从十二指肠开始，同龄KDY 大鼠各节段肠道的微生物分布在门（图2A）、纲（图2B）、目（图2C）、科（图2D）和属（图2E）水平与SD 大鼠均有明显不同。总体上看，KDY 大鼠各肠段的微生物多样性在门、纲、目、科以及属水平均呈下降趋势。有意思的是与SD 大鼠相比，KDY 大鼠各肠段乳酸菌属（Lactobacillus）（图2E）及相应的门（Firmicutes，厚壁菌门，图2A）、纲（Bacilli，芽孢杆菌纲，图2B）、目（Lactobacillales，乳杆菌目，图2C）、科（Lactobacillaceae，乳杆菌科，图2D）的丰度也增高。
图2 KDY 大鼠各肠段菌群丰度变化[（），n=6]Fig.2 Variation of flora abundance in each intestinal segment of KDY rats[（），n=6]
在属水平统计细菌种类数，发现野生型SD大鼠的细菌种类数波动较大。与野生型SD 大鼠相比，KDY 大鼠各肠段菌群多样性总体上具有减少趋势，其中第9 肠段的菌群种类明显减少，差异有统计学意义（P<0.05），见图3。
图3 KDY 大鼠各节段菌群属水平多样性变化Fig.3 Variation of microflora at genus level in each segment of KDY rats
2.3 大鼠粪便菌群变化
同龄KDY 大鼠新鲜粪便微生物分布在门（图4A）、纲（图4B）、目（图4C）、科（图4D）和属（图4E）水平均有明显不同。与肠道菌群变化不同的是，KDY 大鼠粪便中的微生物多样性呈现增加趋势。从属水平（图4E）看，与SD 大鼠相比，KDY 大鼠新鲜粪便克罗诺菌属（Cronobacter）丰度明显减少，差异有统计学意义（P<0.05）。乳杆菌属（Lactobacillus）丰度明显增加，这一点与各肠段的数据一致。
与肠道内菌群不同的是，野生型SD 大鼠和KDY 大鼠粪便中的克罗诺杆菌属（Cronobacter，图4E）丰度均较乳酸杆菌增加，差异有统计学意义（P<0.05）。其所在的门（Proteobacteria，变形菌门，图4A）纲（Gammaproteobacteria，γ-变形菌纲，图4B）目（Enterobacteriales，肠杆菌目，图4C）科（Enterobacteriaceae，肠杆菌科，图4D）的丰度也增高，差异有统计学意义（P<0.05）。
图4 KDY 大鼠新鲜粪便菌群丰度变化Fig.4 Abundance changes of fresh fecal flora in KDY rats
从物种多样性看，野生型SD 大鼠与KDY 大鼠新鲜粪便在门、纲、目、科和属水平上相比均无明显差异（P>0.05），见图5。
图5 KDY 大鼠新鲜粪便不同水平的种类差异Fig.5 Species differences of fresh feces in KDY rats at different levels
2.4 乳酸杆菌属丰度变化
在属水平，不管是在野生型SD 大鼠还是KDY 大鼠，乳酸杆菌属（Lactobacillus）是各段肠中丰度最高的菌属。特别地，KDY 大鼠各肠段乳酸杆菌均处于较高丰度水平，只有在结肠以及粪便中才锐减（可能与乳酸杆菌厌氧有关），但也较野生型SD 大鼠高，差异有统计学意义（P<0.05），见图6。
图6 乳酸杆菌属（Lactobacillus）在各段肠及粪便中的变化趋势Fig.6 Change trend of lactobacillus in intestinal tract and feces
尿酸酶缺失KDY 大鼠的成功研制为研究高尿酸血症、痛风及相关疾病提供了较理想的模型动物[7−12]。雄性KDY 大鼠血尿酸水平远高于野生型SD 大鼠，其血尿酸水平在50～80 µg/mL 之间，与成年男性的血尿酸水平接近[4,12]，但远低于文献报道的尿酸酶缺失小鼠[3]。该大鼠断奶后的1 a 生存率达90%以上[4]，因此KDY 大鼠可用于高尿酸血症、痛风及相关疾病的长期研究。
本研究发现尿酸酶缺失后，各肠段的菌群多样性有下降趋势，且小肠中段（第9 段，相当于空肠和回肠交界处）菌群多样性下降具有统计学差异。不同的是，KDY 大鼠新鲜粪便中的菌群多样性却基本一致，尽管某些菌群的丰度发生了较大改变。
尿液和粪便是尿酸排泄的两个主要途径，一般认为前者约占2/3，后者约占1/3。笔者用KDY 大鼠证实，正常KDY 大鼠的尿液尿酸排泄约占90%，粪便尿酸排泄约占10%[12]，这说明正常情况下肠道尿酸排泄的地位远低于肾脏。特别地，肠道菌群与血尿酸水平的关系尚不明确。考虑到很多细菌表达尿酸酶，寄生在肠道的细菌可能参与尿酸降解代谢，因此有人认为肠道菌群可能有利于血尿酸降低[5−6]。然而笔者前期用雄性KDY 大鼠证明：KDY 大鼠的新鲜粪便含有更多的细菌，且用抗菌药物抑制肠道细菌后血尿酸水平也未发生明显变化[13]，这似乎说明肠道菌群可能不是影响血尿酸的主要因素（高表达尿酸酶的基因工程菌除外）。
由于肠道中真菌的丰度极低，本研究只较系统地用16SrDNA 测序技术研究了雄性KDY 大鼠的各肠段的细菌变化。从整体上看，KDY 大鼠各肠段菌属有减少的趋势，但乳酸菌属的丰度却总体上高于野生型SD 大鼠。考虑到，大多数乳酸菌属于益生菌，该菌属的增加可能有利于维持KDY 大鼠的肠道健康[14]，从而降低其他致病菌或条件致病菌如假单胞菌（Pseudomonas）、支原体（Mycoplasma）、棒状杆菌（Corynebacterium）、不动杆菌（Acinetobacter）、链球菌（Streptococcus）、草螺菌（Herbaspirillum）、梭菌（Clostridiales）、罗思氏菌属（Rothia）和螺杆菌（Helicobacter）的丰度，继而可能有助于对抗尿酸酶缺失后的肠道损伤[15]。且KDY 大鼠肠液的尿酸水平远高于野生型SD 大鼠[12,15]，这种现象可能与高尿酸环境有利于乳酸菌属生存有关。
总之，与野生型SD 大鼠相比，KDY 大鼠肠道和粪便菌群发生了较大变化，在肠道菌群多样性有所减少的趋势下整体增加了乳酸菌的丰度。
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