董 彬，王立志,宋红丽，王国祥，刘 艳
(1：山东省水土保持与环境保育重点实验室，临沂大学资源环境学院，临沂 276000) (2：南京师范大学环境学院，南京 210023)
河流是陆地系统主要的氮汇，每年向海洋输送的氮量约为35 Tg。氮素是我国河流的主要污染物之一，削减氮负荷是河流水环境管理和修复的关键问题。反硝化作用可使氮素以氮气(N2)形式彻底脱离水体，全球输入河流的总氮约有50%通过反硝化作用被去除[1-2]，尽管已发现厌氧氨氧化、甲烷厌氧氧化等脱氮过程在河流中存在，但目前认为反硝化过程仍是河流氮去除的重要途径[3-4]，是调节区域甚至全球尺度上氮循环的关键过程[1]。目前对河流反硝化作用的研究场所主要集中在沉积物-水界面和上覆水中，普遍认为河流沉积物由于含有丰富的有机质、氮(N)、磷(P)、硫(S)和微生物等，是反硝化发生的主要场所[2,5]。
自然水环境中反硝化作用通常出现在很薄(μm～mm)的基质层内[6]。氮负荷较高的水体中，沉水植物茎叶表面常有一层附着生物膜，其结构和物质组成复杂，存在氧化-还原异质微环境[7-8]，且营养物质丰富，是氮素循环及生命活动较为强烈的场所[9]。已发现在夏季养分和水生植物丰富的浅水河流和人工湿地中，沉水植物马来眼子菜(PotamogetonmalainusMiq)、金鱼藻(CeratophyllumdemersumL.)、穗状狐尾藻(MyriophyllumspicatumL.)、苦草(Vallisnerianatans)，挺水植物芦苇(Phragmitesaustralis)附着生物膜的反硝化活性较高，反硝化作用贡献(38.96%～67.56%)已接近甚至超过沉积物的贡献[9-11]，是不可忽视的反硝化场所。在富营养化水体中，沉水植物菹草(Potamogetoncrispus)春季适宜温度(10～20℃)下暴发生长(“疯长”)可造成生物量(2.0～5.3 kg/m2)和盖度(>80%)过大[12]，可能会强烈影响水生态系统中的硝化、反硝化过程，促进氮去除。但相关研究非常匮乏，限制了河流氮收支的精确计算及氮汇的评价。
沂河是发源于山东省境内最长的河流，由于临沂市城区段受污水排放、橡胶坝及人类活动影响，水污染负荷压力较大，水体氮磷养分丰富，菹草已成为春季该水域的绝对优势种，每年4、5月份均有暴发现象，由菹草引发的水质污染问题成为已成为关注的焦点，常采用收割打捞的方式清除菹草，但对河流生态系统的干扰较大，且忽略了菹草的生态功能。暴发生长期菹草生物量增长迅速，为附着生物膜提供了巨大的附着表面，附着生物膜反硝化作用如何变化？单位河流面积上附着生物膜反硝化脱氮潜力有多大？其对水生态系统氮去除的贡献如何？是否河流反硝化作用的热点？这些问题目前尚不清楚，难以客观科学地评价菹草暴发生长对水体的环境效应。鉴于此，本研究选择沂河城区段菹草进行观测研究，主要目的是分析暴发生长阶段菹草附着生物膜的反硝化作用变化特征，探明附着生物膜反硝化脱氮潜力，为菹草的科学管控和生态系统服务功能的提高提供科学依据。
1.1 研究区概况
在沂河临沂市城区段，沂河桃园橡胶坝与小埠东橡胶坝、角沂橡胶坝、刘家道口枢纽相连形成面积36 km2的沂蒙湖。经过近几年的生长繁殖，菹草已成为临沂市中心城区水域的绝对优势种，占所有沉水植物的90%以上，每年4月至5月中下旬，菹草覆盖大部分水面，生物量达到最大，阻挡了80%以上的光，抑制了水中浮游藻类的生长。白天菹草的光合作用较高，夜间由于菹草的呼吸作用可将水体中氧气(O2)消耗至1 mg/L以下[8]，有利于反硝化作用进行。在前期野外调查基础上，选择沂河城区段6个典型样点(图1)进行研究，各采样点水体理化特征、菹草丰富度存在差异(表1)，S1、S2样点菹草丰富度为中，S3、S4样点菹草丰富度高(图2)，S5、S6样点菹草丰富度低。在菹草快速生长季节(3月底至5月下旬)监测其丰富度变化。2019年从4月初开始在上述地点采集菹草、水和沉积物样品，至5月下旬菹草叶片出现大量分解时采样结束，每7～10天采样1次。
图1 菹草观测点示意图Fig.1 Sampling sites of Potamogeton crispus
表1 菹草暴发生长前采样点水体理化特征*Tab.1 Parameters of river water at the sampling sites
图2 沂河采样点S3菹草暴发情况(2019年4月30日)Fig.2 Photographs of Potamogeton crispus during explosive growing at S3 in Yi River
1.2 菹草、水和沉积物样品的采集
在每个采样点随机选择3个样方(0.5 m×0.4 m)，样方间隔50～100 m，用水草夹小心采集每个样方的全部菹草装入无菌袋，然后在每个样方内用柱状采泥器采集完整沉积物底泥柱(深10 cm，直径8.4 cm)3个，采集表层水样2000 mL。用便携式参数检测仪(Hach, USA)在每样方现场测定水温(WT)、溶解氧(DO)、pH和氧化还原电位(Eh)等。取表层(0～5 cm)沉积物柱样，两端封好。植物、底泥和水样置于恒温保温箱中立即运回实验室。
1.3 反硝化作用样品的培养实验和产物N2的分析
表2 实验中使用的营养液组成Tab.2 Constitution of the nutrient solution used in the experiments
1.4 反硝化作用速率和厌氧氨氧化作用速率计算
根据膜进样质谱仪测定的溶液中产生的28N2、29N2、30N2浓度，通过同位素配对计算反硝化作用速率和厌氧氨氧化作用速率[9,15-16]。
(1)
(2)
为便于比较菹草附着生物膜反硝化作用、厌氧氨氧化作用和沉积物反硝化作用及厌氧氨氧化作用，将反硝化速率单位转换为通用单位μmol/(m2·h)。单位河流面积上菹草附着生物膜的反硝化作用速率和厌氧氨氧化速率通过菹草生物量(g/m2)、菹草样品占地面积(m2)、蠕动泵流速(mL/min)、N2的浓度(μmol/L)进行换算；
单位河流面积上沉积物的反硝化速率和厌氧氨氧化速率根据沉积物柱横截面面积(m2)、蠕动泵流速(mL/min)、N2的浓度(μmol/L)进行换算。
1.5 附着生物膜样品的采集与分析
附着反硝化细菌的定量分析采用荧光定量qPCR方法。用超声法洗脱附着细菌[9]，真空抽滤至滤膜 -80℃ 保存。附着细菌反硝化功能基因扩增与荧光定量分析委托上海美吉生物科技有限公司进行。DNA浓度和纯度使用Nanodrop 2000微量紫外分光光度计检测。反硝化功能基因nirK、nirS和nosZ扩增使用引物及序列见表3。使用ABI7500 型荧光定量PCR仪进行扩增，扩增体系如下：2×ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix 16.5 μL，上下游引物各0.8 μL，DNA 模板2 μL，加无菌ddH2O水补足20 μL。所有样品进行3次重复扩增，最后所得功能基因拷贝数为3次重复的均值。扩增结果使用StepOne Software vv2.2.2 进行人工校准。
表3 定量扩增使用引物及反应程序Tab.3 Primer pairs and sequence used in qPCR
1.6 统计分析
利用SPSS 25.0软件对数据进行统计分析，利用单因素方差分析(ANOVA)分析不同日期附着生物膜反硝化速率的差异显著性，采用OriginPro 9.0软件绘图。
2.1 菹草暴发生长特征
春季沂河临沂城区段菹草生长呈单峰变化模式(图3)，暴发生长阶段，菹草生物量呈指数增长趋势。3月下旬，6个监测点均有菹草零星出现，生物量(鲜重)为20～114 g/m2；
随着水温升高，菹草生长加速，4月上旬，河岸浅水区菹草接近水面，分布面积明显增加，仍呈点状分布；
4月中旬，菹草进入暴发生长阶段，生物量增长迅速(860～1926 g/m2)，菹草沿河呈带状分布，宽度为30～50 m，随水温升高菹草扩展速度加快，菹草带明显增大。5月1日前后，在S3～S4河段，菹草布满河面，盖度在80%以上(图2)，菹草生物量、盖度持续增加，菹草进入繁殖期，结实大量芽殖体，菹草生长进入稳定阶段。5月8日，6个采样点生物量均达到最大(1817～3334 g/m2)，在水面附近形成致密的冠层，分别为3月27日生物量的58.37、44.82、29.25、54.04、56.97、90.85倍。
图3 菹草暴发性生长阶段生物量变化Fig.3 Curves of Potamogeton crispus biomass during burst explosive growing stage
2.2 菹草附着生物膜反硝化作用显著增强
菹草暴发生长阶段，各采样点菹草附着生物膜反硝化速率迅速升高(图4)，与菹草生物量变化趋势一致。4月3日，各采样点菹草附着生物膜的反硝化速率均处于最低水平(2.12～8.38 μmol/(m2·h))。随着菹草生物量的增加和水温的升高，菹草附着生物膜反硝化速率显著升高，且明显高于沉积物的。暴发生长阶段，不同日期菹草附着生物膜反硝化作用差异显著，5月1日-5月8日，各采样点菹草附着生物膜的反硝化速率达到最大，分别为936.97、1192.82、1728.39、1337.33、686.71、424.18 μmol/(m2·h)。暴发生长期间，菹草附着生物膜反硝化脱氮远超过厌氧氨氧化，占比达77%～96%。与菹草生物膜反硝化相比，沉积物的反硝化速率相对较低，且变化幅度较小(15.10～49.24 μmol/(m2·h))(图4b)。
图4 暴发生长期间菹草附着生物膜反硝化、厌氧氨氧化和沉积物反硝化速率 (箱图的上方和下方的线段分别表示第三四分位数和第一四分位数，箱图中间 的线段表示中位数，箱图外最上方和最下方的线段表示范围从第5百分位到第95百分位)Fig.4 Rates of denitrification and anammox in epiphytic biofilms on Potamogeton crispus and rates of denitrification in sediments (Each box indicates the 25th and 75th percentiles, and horizontal line indicates median value, and whisker shows range from the 5th to 95th percentile)
2.3 菹草附着生物膜增多
暴发生长阶段，随着菹草的快速生长，附着物干重逐渐增加，总细菌丰度、反硝化细菌功能基因nirK、nirS和nosZ丰度以及TN、TOC含量均显著增加(图5)。菹草附着物TOC含量(16.33～98.21 mg/g)和TN含量(1.65～4.56 mg/g)较高，附着物的养分量丰富，可为附着生物进行反硝化作用提供丰富的碳源和氮源。
图5 菹草暴发生长期间附着生物膜各指标变化特征Fig.5 Variation characteristics of epiphytic biofilms on Potamogeton crispus during explosive growing stage
2.4 水体氮负荷变化
图6 菹草暴发生长期间水体氮浓度变化 Fig.6 Variation characteristics of nitrogen concentration in water during Potamogeton crispus explosive growing stage
3.1 菹草附着生物膜成为反硝化作用热点
春末夏初，在菹草暴发生长阶段(4月中旬-5月中旬)，沂河、祊河城区段菹草生物量可达1817～3334 g/m2，覆盖面积可达30%～90%。当按菹草单位叶表面积来计算附着生物膜的反硝化速率时，它远低于沉积物的反硝化速率，但当按单位河流面积计算时，附着生物膜的反硝化速率则高于沉积物的。以5月1日各采样点为例，菹草附着生物膜的反硝化速率高达424.18～1728.39 μmol/(m2·h) ，而沉积物反硝化速率为24.53～62.45 μmol/(m2·h)，是表层沉积物反硝化速率的17.29～29.09倍，占该日通过反硝化作用氮去除总量的96%，成为反硝化作用的热点区域。在菹草暴发期间，菹草生物膜通过反硝化作用产生的N2可占河流反硝化脱氮作用的70%～97% (图4b)。类似的高反硝化速率在其他富营养化水体亦有发现，蓝藻水华期太湖水柱的反硝化速率可达(534.45±242.18)～(1614.52±301.57) μmol/(m2·h)[25]，Hudson河岸带入侵植物菱Trapanatans丰富的区域反硝化速率高达1541.7～2958.3 μmol/(m2·h)[10]。
3.2 菹草的科学管理建议
研究表明，当菹草生物量超过2000 g/m2即可视为过度生长(暴发)[12]，依据这一标准，本研究6个监测点中有5个点达到了暴发水平。目前相关管理部门普遍认为彻底清除菹草是解决菹草引发的水质污染问题的有效方法。本研究认为，通过科学管理，充分利用菹草强大的养分吸收功能和附着生物膜高效的反硝化脱氮功能降低水污染负荷更有助于解决问题，提高河流生态系统的服务功能。建议如下：
1)构建镶嵌型水生植物群落。可在沂河菹草区种植本地物种金鱼藻、穗状狐尾藻、黑藻(HydrillaverticillataRoyle)等沉水植物，春末生根发芽，夏初菹草衰亡时长至水面，使沉水植物群落有效交替，充分发挥沉水植物附着生物膜的生态功能，可缓解菹草衰亡带来的不利影响。
2)适度收割。合理地收割既有利于沉水植物的恢复和生长，又可缓解生物量过度集中于水体表层的趋势，提高群落持续净化水质的稳定性。在菹草生长中期对其进行60%～80%收割，可控制菹草过度生长，并维持水体养分负荷在较低水平[29]。因此，可以通过适时、适量收割来控制沂河城区段菹草暴发，理想割草时间为4月下旬，此时芽殖体尚未发育成熟，避免来年菹草大面积发生。使其既能充分发挥其生物脱氮作用，又可避免因密集衰亡分解对水环境造成的负面影响。
3)调控水位。假设透明度保持不变，水位提高1 m，水下太阳辐照度将降低56.5%，可显著降低菹草所需的光照，从而抑制菹草生长[30]。4月是沂河祊河菹草生长的关键时期，在条件允许的情况下，可以利用橡胶坝的调蓄功能适当增加河流蓄水量，抬高水位，进而抑制其过度生长。
1)4月上旬-5月初为营养丰富的沂河菹草暴发增长期，生物量增加迅速，5月8日监测点最大生物量为1817～3334 g/m2。
2)暴发生长阶段，菹草附着生物膜厚度和干重逐渐增加，反硝化功能基因丰度、TOC、TN均显著增加，为附着生物膜反硝化作用提供了丰富的能源和微环境条件。
3)暴发生长期，菹草附着生物膜成为反硝化作用热点。菹草附着生物膜反硝化作用最大速率为424.18～1728.39 μmol/(m2·h)，是表层沉积物反硝化作用的17.29～29.09倍。菹草附着生物膜反硝化作用是沂河临沂城区段春季生态系统氮去除的重要环节，环境意义重大。
4)可通过构建镶嵌型沉水植物群落、适度收割、调控水位等措施来缓解菹草暴发，提高河流生态系统的服务功能。
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