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摘 要 为确定高效液相色谱法测定木薯β-胡萝卜素的最佳方法，以丙酮/石油醚（2/5，V/V）为提取液，甲醇/叔丁基甲醚（70/30，V/V）为流动相，对白心木薯SC101和蛋黄木薯SC9块根β-胡萝卜素保留时间及其分离情况进行研究。检测条件为：色谱柱YCM C30，柱温30℃，流速为1 mL/min等度洗脱。结果显示：该方法精确度和重复性的变异系数均小于5%，保留时间为12.65 min，在2～30 μg/mL浓度范围内线性关系良好（y= 209.11x-14.114，R2=0.9993）；平均回收率为81%～92 %。采用改进的HPLC法对木薯块根β-胡萝卜素进行测定，数据稳定性好，分析时间比已报道的方法缩短30 min以上，适用于快速定量分析木薯块根的微量β-胡萝卜素含量。
关键词 木薯 ；β-胡萝卜素；HPLC；定量分析
分类号 S482.4
Optimization of HPLC Determination Method for β-carotene
in Cassava Tuberous Roots
YANG Long ZHOU Kai AN Feifei LI Kaimian CHEN Songbi
（1 Tropical Crops Genetic Resources Institute / Key Laboratory of Ministry of Agriculture for Germplasm Resources Conservation and Utilization of Cassava， CATAS，Danzhou 571737；
2 Subtropical Crops Research Institute of Guizhou Province， Xingyi， Guizhou 562400）
Abstract In order to determine the optimization of HPLC determination method for β-carotene， the retention time and separation conditions of β-carotene extracted from tuberous roots of white cassava SC101 and yellow cassava SC9 were analyzed using acetone/petroleum ether （2/5， V/V） mixtures as extraction buffer and methanol/tert butyl methyl ether （70∶30） mixtures as mobile phase. Chromatography conditions were as follow： chromatographic column， YCM C30； column temperature， 30℃； Isocratic flow rate， 1 mL/min. The results showed that the coefficient of variation regarding precision and reproducibility determining β-carotene contents in this method was less than 5%. The retention time for β-carotene determination was 12.7 min during this experiment. β-carotene within 2～30 μg/μL had a good linearity （y=209.11x-14.114，R2=0.999 3）. The average recovery was from 81% to 92%. In the present study，the measured data regarding β-carotene determination was stable. The analysis time for β-carotene determination in the experiment was at least less than 30min compared with the previous studies. It is suitable for the quantitative analysis of small amount β-carotene in cassava tuberous roots.
Keywords cassava； β-carotene； HPLC； quantitative analysis
木薯（Manihot esculenta Crantz） 是三大薯类作物之一，是世界上近8亿人口的主粮[1-2]。类胡萝卜素是人类所需的营养成分之一，也是人体合成维生素A的前体。因此，木薯块根中β-胡萝卜素的含量成为衡量其营养价值的重要指标，长期食用含类胡萝卜素低的木薯，会引起夜盲症、干眼病、角膜软化等症状[3-4]。据研究，深黄甜木薯的营养价值较高，其块根中β-胡萝卜素含量占总类胡萝卜素含量的90%以上[5-6]。植物中类胡萝卜素种类繁多，结构复杂，理化性质不稳定，如采用传统的分光光度法测量β-胡萝卜素，数据线性范围大，结果精确度差[7]。近几年，国内运用高效液相色谱法（HPLC）对不同作物进行β-胡萝卜素分析测定，分离效果好，效率高，精确性和准确度高。然而，不同作物的提取方法和不同检测方法不尽相同，如甘薯[8-9]、油菜[10]和桃果实[11]等。
木薯中β-胡萝卜素测定主要采用紫外分光光度法，其测量结果波动性较大，准确度和精密度较差[12-13]。Kimura等[14]用YMC C30色谱柱，流动相为甲醇：叔丁基甲醚（80∶20，V/V），流速为0.8 mL/min，等度洗脱，对木薯β-胡萝卜素进行测定分析，分离效果好、线性关系好，数据准确可靠，但其检测时间较长，不能在短时间内批量测定木薯中β-胡萝卜素含量。本研究在Lucia等[15]方法的基础上进行改进，以期获得高效测量木薯块根β-胡萝卜素的分析方法。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验材料与试剂
选取种植在中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所国家木薯种质资源圃8个月的白心木薯SC101和蛋黄木薯SC9块根为实验材料。
甲醇（色谱纯）、叔丁基甲醚（色谱纯），购自Sigma公司；丙酮：分析纯，购自广州化学试剂厂；β-胡萝卜素标准品：美国 Sigma 公司。
1.1.2 仪器
Agilent 1260 型高效液相色谱系统（配有可变波长紫外检测器）：美国Agilent公司；色谱数据处理由 Agilent 1260 LC 软件完成；氮吹仪（NDK200-2）、涡混仪（QL-861）等。
1.2 方法
1.2.1 β-胡萝卜素提取
木薯块根β-胡萝卜素提取参照Kimura[14]、Lucia[15]、GB/T5009.83-2003食品类胡萝卜素提取方法[16]和甘薯β-胡萝卜素提取方法[8，17]，并做适当改进。木薯块根样品经清洗、晾干，薯皮和薯肉分开切碎混匀，用液氮冻干后研磨成细粉。称取粉末（约1.0 g）转入10 mL离心管，加入2 mL冷冻丙酮涡混后再加入2 mL冷冻石油醚，涡混，于4℃，3 000 r/min，离心5 min后取上清液转入10 mL离心管。剩余残渣加入1 mL石油醚，涡混、离心，重复提取3次，直至残渣变为无色。收集样品液用弱氮气吹干，加入500 μL丙酮溶解，一次性针筒收集溶解液，一次性滤膜（0.45 μm）过滤后收集样品液置于棕色样品瓶（含内衬管），作为本实验的分析样品。
1.2.2 β-胡萝卜素HPLC分析
1.2.2.1 优化方法
根据Kimura[14]、Lucia[15]、Carvalho等[18]对2种木薯品种块根β-胡萝卜素进行HPLC分析，发现YCM C30色谱柱比C18柱子分离效果好，叔丁基甲醚为流动相洗脱效果佳。不同色谱条件可以得到不同分析结果，为快速检测木薯块根β-胡萝卜素，本研究在前人研究的基础上，对色谱条件做以下改进。色谱柱：YCM Carotenoid S-3 柱，4.6 mm ×250 mm，美国 Waters 公司；柱温：30℃；流动相：色谱纯，甲醇/叔丁基甲醚（70/30，V/V）等度洗脱；流速：1 mL/min；进样量：20 μL；测定波长：450 nm。
1.2.2.2 β-胡萝卜素标准品制备和标准曲线绘制
精确称取β-胡萝卜素标准品 125 mg，置于250 mL 棕色容量瓶，丙酮溶解并定容至250 mL，作为标准母液（浓度500 μg/mL）。用丙酮将母液分别稀释成2、5、10、15、30 μg/mL。以峰面积（y）对标准品浓度（x）进行线性回归分析，绘制标准曲线。
1.2.3 β-胡萝卜素含量测定方法确立
1.2.3.1 精确度测定
同一β-胡萝卜素标准品溶液（10 μg/mL）连续测定10次，并记录β-胡萝卜素保留时间（Rt）和吸收峰面积（mAU·s），计算平均值及变异系数（CV）。
1.2.3.2 重复性及样品稳定性测定
样品重复性检测选取蛋黄木薯SC9块根肉样品，按1.2.1 的方法制备 6 份样品测定溶液，样品进样量设定为20 μL进行色谱测定。样品稳定性检测时，选取样品分别在制备后0、4、8、12、24 h进样测定，记录β-胡萝卜素的保留时间和吸收峰面积，计算其平均值及变异系数。
1.2.3.3 加标回收率实验
按加标回收率要求，在已知含量的木薯块根样品中加入3个浓度水平（5、10、15 μg/mL）的标准液，测定其回收率。
1.2.3.4 样品β-胡萝卜素含量的测定
分别提取白心木薯SC101和蛋黄木薯SC9块根薯皮和薯肉的β-胡萝卜素，每个样品3次重复。采用HPLC优化方法获得β-胡萝卜素峰面积，利用以下公式计算样品β-胡萝卜素含量，结果以平均值（±）标准误表示。计算公式为：
C（μg/g）=
式中：C为样品β-胡萝卜素含量（μg/g）；Ax为样品峰面积；Cs为标准品浓度（μg/mL）；V为样品定容体积（mL）；As为标准品峰面积；P（g）为样品质量。
1.2.4 统计分析
采用Excel 2013和DPS v7.05软件对试验数据进行统计分析，差异显著性标准采用邓肯氏新复极差法进行统计分析。
2 结果与分析
2.1 β-胡萝卜素标准曲线制定
β-胡萝卜素标样的标准曲线如图1。采用一元线性回归法得峰面积积分值（y）与β-胡萝卜素（x）之间的回归方程为：y=209.11x-14.114 （R2=0.999 3）。结果表明，在2～30 μg/mL范围内，β-胡萝卜素与峰面积的线性关系良好。因此，该曲线可作为HPLC法测定微量β-胡萝卜素含量的标准。
2.2 HPLC精确度和重复性分析
为检测该方法的精确度和可重复性，取20 μL标准溶液（10 μg/mL），连续10次重复进样，测定保留时间和吸收峰面积。β-胡萝卜素的保留时间和峰面积如表1所示，β-胡萝卜素的保留时间12.73 min，平均值变异系数为0.40，峰面积平均值2 212.56 mAU·s，变异系数为1.23，均小于5。β-胡萝卜素浓度平均值10.65 μg/mL，变异系数1.22，小于5。说明此检测方法结果准确可靠，HPLC的精确度高，符合实验要求。
对SC9木薯块根肉样品进行6次重复检测，结果如表2所示，β-胡萝卜素的平均保留时间12.65 min，变异系数为0.47，峰面积平均值521.00 mAU·s，变异系数为4.4，β-胡萝卜素浓度平均值2.56 μg/mL，变异系数4.68，均小于5。表明本方法重复性好。
2.3 液相色谱图线性范围
β-胡萝卜素标准品（20 μg/mL）经HPLC分离，用波长为450 nm的紫外光谱扫描得到紫外光谱图，β-胡萝卜素保留时间为12.65 min（图2A）。蛋黄木薯SC9和白心木薯SC101块根薯肉样品经HPLC分离后均获得β-胡萝卜素的紫外光谱图（图2B、2C），保留时间均为12.65 min，但SC9块根肉的色谱峰面积远大于SC101。
2.4 样品稳定性分析
以SC9块根薯肉作为样品检测该方法的稳定性，于样品制备后0、4 、8、12、24 h后进样测定。通过对提取样品后不同时间段进样检测发现，β-胡萝卜素保留时间平均为12.61 min，变异系数为0.22，峰面积平均为475.37 mAU·s，变异系数为8.03，β-胡萝卜素浓度平均值2.34 μg/mL，变异系数7.69，均小于10，说明样品在24 h内符合检测要求。随着时间延长，样品峰面积呈递增趋势（表3）。
2.5 回收率测定
在已知含量样品中，加入3个浓度水平的标准液测定其加标回收率，结果见表4。3个浓度水平的标准液平均回收率分别为87.7%、80.7%和92.1%；对应变异系数分别为3.19、2.04和1.20，全部均小于5，表明该检测方法回收率良好。
2.6 样品β-胡萝卜素含量测定
白心木薯SC101和蛋黄木薯SC9块根薯皮和薯肉β-胡萝卜素含量测定结果见表5。可以看出，SC101块根薯皮和薯肉β-胡萝卜素含量较低，且差异不显著；蛋黄木薯SC9块根薯肉β-胡萝卜素含量是薯皮的2倍，且差异显著；与白心木薯相比，蛋黄SC9块根薯肉β-胡萝卜素含量是SC101的7倍。
3 讨论与结论
β-胡萝卜素的HPLC测定分析方法因其具有高柱效、高选择性、高灵敏度、用样量少、可重复、分析速度快等优点，被国内外研究者作为分析β-胡萝卜素含量的首选[19]。木薯块根中β-胡萝卜素的HPLC测定分析方法前人已有研究（表6），方法一用C18柱，流动相为乙腈∶甲醇∶乙酸乙酯（80∶10∶10，V/V/V），流速为0.7 mL/min，HPLC检测时间比方法二和方法三短，但分离效果较差。方法二与方法三采用YCM C30柱，流动相为甲醇∶叔丁基甲醚（80∶20，V/V），流速为0.8 mL/min，样品分离效果好，但HPLC检测时间较长。本研究根据上述3种检测方法进行改进：流动相为甲醇∶叔丁基甲醚（70∶30，v/v），流速为1.0 mL/min。结果显示，改进方法保留时间为12.65 min左右，缩短了分析时间，分离效果佳，精确度高，重复性好，能够满足快速检测木薯块根β-胡萝卜素含量的要求。
目前中国食品中β-胡萝卜素含量的检测标准也采用HPLC法[7]，虽然能使类胡萝卜素分离好，但样品处理前需经氧化铝过滤层析，比较繁琐，分析时间长，耗时50 min（未发表数据）。在木薯β-胡萝卜素分析过程中，Kimura[14]和Lucia[15]均采用丙酮做提取液，提取样品虽然过程简单，但样品分离纯化步骤较复杂，分析时间较长，样品稳定性差。采用本研究的改进方法进行检测，样品前处理简单快速，操作容易，回收率范围在80.7%～92.1%。在0～24 h内，样品重复性和稳定性均满足检测要求。利用该方法对白心木薯SC101和黄心SC9块根中β-胡萝卜素含量进行检测，结果显示，黄心木薯块根薯皮和薯肉β-胡萝卜素含量远高于白心木薯，为木薯食用品种的筛选提供理论依据。
参考文献
[1] 林 雄，李开绵. 海南岛木薯种质资源考察报告[A]. 华南热带作物科学研究院，中国农业科学院作物品种资源研究所，海南岛作物（植物）种质资源考察文集[C]. 北京：农业出版社，1992：33-38.
[2] Li K， Zhu W， Zeng K， et al. Proteome Characterization of cassava （Manihot esculenta Crantz） somatic embryos， plantlets and tuberous roots[J]. Proteome Science，2010，1477-5956-8-10.
[3] Anonymous. Report of a Joint WHO/FAO/UNU expert consultation： Protein and amino acid requirements in human health [R]. in WHO Technical Report Series， 2007.
[4] Stephenson K， Amthor R， Mallowa S， et al. Consuming cassava as a staple food places children 2-5 years old at risk for inadequate protein intake，an observational study in Kenya and Nigeria [J]. Nutrition Journal， 2010， 1475-2891-9-9.
[5] Iglesias C， Mayer J， Cha′vez AL，et al. Genetic potential and stability of carotene content in cassava roots [J]. Euphytica，1997， 94： 367-373.
[6] Ortega-Flores C I， Lopes da Costa M A， Cereda P，et al. Bioavailabilty of β-carotene in dehydrated yellow cassava （Manihot esculenta Crantz）. La biodisponibilidad de β-caroteno en yuca deshidratada hojas （Manihot esculenta Crantz） [J]. Cie^nc Tecnol Alim， 2003， 23（3）： 473-477.
[7] 张英宣，张 莉. 胡萝卜中类胡萝卜素全量的测定[J]. 中国食物与营养，2006，（6）：24-25.
[8] 秦宏伟，杨红花，史春余，等. 甘薯中β-胡萝卜素提取工艺研究[J]. 食品科学，2007，28（1）：123-125.
[9] 孙 健，彭宏祥，董新红，等. 甘薯中β-胡萝卜素HPLC测定方法分析[J]. 食品科技，2009，34（1）：236-239.
[10] 曾德志. 不同颜色油菜花瓣中主要类胡萝卜素的含量及相关基因的表达分析[D]. 成都：四川农业大学，2013.
[11] 颜少宾. 桃果实发育阶段类胡萝卜素的变化分析[D]. 南京：南京农业大学，2012.
[12] 简纯平. 采后木薯块根贮存能力及蛋白质组学分析 [D]. 海口：海南大学，2012.
[13] 徐 娟，黄 洁. 6份木薯种质营养成分与食味的初步分析及评价[J]. 热带作物学报，2013，34（1）：373-376.
[14] Kimura M， Cintia N， Delia B， et al. Screening and HPLC methods for carotenoids in sweet potato，cassava and maize for plant breeding trials[J]. Food Chemistry， 2007， 100： 1 734-1 746.
[15] Lucia M， Alcides R， Ronoel L， et al. Retention of total carotenoid and β-carotene in yellow sweet cassava （Manihot esculenta Crantz） after domestic cooking [J]. Food & Nutrition Research，2012， 56：15 788.
[16] G B/T5009.83- 2003，食品中胡萝卜素的测定[S].
[17] 吴 鑫，杨柳桦，曾 果，等. 高效液相色谱法测定甘薯中β-胡萝卜素[M]. 中国卫生检验杂志，2006，16（9）：1 056-1 058.
[18] Carvalho L， Lippolis J， Chen S， et al. Characterization of Carotenoid-protein Complexes and Gene Expression Analysis Associated with Carotenoid Sequestration in Pigmented Cassava （Manihot esculenta Crantz） Storage Root[J]. The Open Biochemistry Journal， 2012， 6： 116-130.
[19] 莫玉楠，张鲁刚，王国芳. 橙色大白菜类胡萝卜素提取与测定方法研究[J]. 西北农林科技大学学报（自然科学版），2014，42（3）：206-214.