摘 要 实验以w-13、w-15、w-17，zyz-4892等四个豌豆品系为观察对象，用石蜡切片发和平板培养法观察豌豆的根瘤形态结构和根际微生物群落。结果表明，豌豆品系w-17与本地土著根瘤菌适应性最好，其次是w-15，而zyz-4892与w-15不适应本地根瘤菌。在土壤微生物培养中发现，根瘤数量可能与根际细菌数量成正线性相关，而土壤根际放线菌的数量，结瘤明显的w-13和w-17品系是结瘤不明显品系w-15和zyz-4892的9倍。
关键词 豌豆；根瘤结构；根际微生物
中图分类号：S643.3；S154.3 文献标志码：A 文章编号：1673-890X（2015）12-001-02
豌豆（Pisum sativum）是继大豆之后的第二大食用豆类作物[1]，富含碳水化合物、脂肪、蛋白质、粗纤维以及维生素B1、维生素B2、维生素C等。豌豆具有根瘤固氮的特性，种植豌豆可以用地养地结合，粮、菜、饲兼用，豌豆作物在农业生产和自然氮素平衡中发挥着重要作用。应用生物固氮能有效减少氮肥的使用，对农业经济的可持续发展有至关重要的战略意义。
大量研究表明，在高产豌豆种植技术中，人工根瘤菌接种是提升豌豆产量的有效途径。但是有些研究指出，在实际农业种植中接种根瘤菌的增产效果有时并不明显，这可能是因为土壤中有大量的竞争能力强但固氮效率低的土著菌群，它们对接种的根瘤菌竞争结瘤的能力产生了干扰和削弱。接种根瘤菌是否成功，大部分来自于接种的菌株的结瘤竞争能力，而结瘤率是测量竞争结瘤能力的重要指标。本实验选取四个豌豆品系，以豌豆的根瘤和根际微生物为研究对象，用石蜡切片法、平板梯度稀释法研究豌豆根瘤结构和豌豆根际微生物群落的分布，分析影响豌豆结瘤的因素，为农业生产中人工接种根瘤菌提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 供试豌豆品系
处在开花时期的豌豆品系w-13、w-15、w-17，zyz-4892。四个豌豆品系的根瘤均来自湖北豆类（蔬菜）植物工程技术研究中心永安基地。采集时，观察根瘤的形态及着生位置，经清洗后及时固定于FAA液中。
1.2 实验方法
根瘤结构观察用石蜡切片法；微生物的数量测定采用平板梯度稀释法。其中细菌培养基为牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，真菌培养基为PDA培养基，放线菌培养基为高氏1 号琼脂培养基。
2 结果与分析
2.1 四个豌豆品系的根系形态及结瘤情况比较分析
从图1可以看出，在4个豌豆品系中，w-13的侧根数目最多，侧根密度最大，其次是zyz-4892；w-17上可以看到其水平生长优势明显，二级侧根数量较多，且有较长的侧根分枝；zyz-4892的侧根细长，侧根上分枝稀疏，根表皮颜色较其它3个品系浅；w-15在4个品系中的主根最发达，侧根较粗，但侧根数量最少，侧根的分枝密度与zyz-4892程度相似。4个豌豆品系中仅有w-13和w-17有一定数量的根瘤，且有10 mm以上根瘤形成，最大的达到20 mm；zyz-4892只有少量几个根瘤形成，与w-13和w-17上形成的较小的根瘤相似，大小多为2～4 mm；在w-15上并没有找到明显的根瘤状组织。所有根瘤形成的位置都在较细的侧根上。根瘤的形状、颜色、大小随品系的不同差异并不明显，根瘤的形状均为长枣状、姜状或珊瑚状；根瘤的颜色为乳白色、浅黄色、浅褐色或者褐色。
2.2 不同豌豆品系根瘤结构观察
从横切面（图2）观察可以看到，被染成深红色的中心含菌细胞区和染色较浅的外皮层。在发现根瘤的3个豌豆品系中，在皮层细胞的细胞壁位置可以有看到有染成红色的根瘤菌，其中以w-13的最为明显；含菌细胞区是根瘤固氮的主要位置，在3个豌豆品系中，w-17的含菌细胞区几乎全被感染细菌所占满，以染色的程度来看，w-17的感染细胞在中心位置分布均匀，而且感染率最高，由此可以看出，w-17与本地土著根瘤菌的适合度最高；从皮层与含菌细胞之间的分生组织中可以看，出本地根瘤菌在w-17中生长最旺盛。在w-13中，也可以看到，一定数量的分生组织，但含菌细胞区的细胞感染率没有w-17的高，且感染面积没有w-17大。zyz-4892的中心含菌区与皮层界界限不明显，且含菌细胞区感染细胞分布稀疏，分生组织数量较少。从高倍镜下观察中心含菌细胞区，可以看到，染色部位多处于细胞壁位置，由皮层细胞中也可观察到染红的菌体分布可知根瘤菌沿着细胞间隙在内部延生，包围细胞后向细胞内部侵入。
2.3 根际土壤微生物的分布
4个豌豆品系的根际土壤细菌数量呈现显著性差异（p<0.05），数量最多的是w-13，其次依次是w-17、zyz-4892、w-15，这与根瘤数量的多少的顺序相一致；w-17的根际土壤真菌数量显著高于zyz-4892，而zyz-4892的真菌数量显著高于w-13和w-15；在w-13和w-17的根际土壤中放线菌数量无明显差异（p>0.05），但它们的放线菌数量均显著高于zyz-4892和w-15（p<0.05），且数量均在zyz-4892和w-15的9倍以上（图3）。
3 讨论
在田间种植中，不同品系的豌豆结瘤差异可能与根瘤菌的宿主专一性相关，有很多不同的类型和数量的土著菌存在土壤中，它们可以最有效地利用土壤中有限的碳源，使它们在结瘤竞争中得到有力地位。从4个豌豆品系的根瘤结构来看，w-17和w-13均有与土著固氮菌较好的适应性，尤其以w-17适应性最好，这应该与土壤中的根瘤菌种类相关，以往的研究也表明，至今为止还没发现能在结瘤竞争方面超过土著根瘤菌的根瘤菌[2]。
在4个豌豆品系中，根际微生物中真菌数量均较高，可能与花期时根际微生物变化有关，陈宏宇等人在大豆品系合丰25号根表面及根际微生物体系的变化中也说明大豆根际细菌在生育期数目有递减的趋向，在成熟期根际的真菌有大批的聚集[3]。根际土壤中大量放线菌生长，可能与放线菌为腐生型菌和田间较高的肥力有关，而w-13和w-17根际防线菌数量远高于zyz-4892和w-15，可能w-13和w-17较高的结瘤率有关，有前人研究发现在草本中，豆科植物的根际放线菌数目显著高于非豆科植物[4]，即可能在同一物种内根瘤较多的个体，根际放线菌数量多于其它个体。
根瘤菌竞争结瘤的影响因素还有很多，如土壤类型、肥沃程度、异类微生物的竞争、寄主的病虫害和一些农业措施。等。近年来，随着分子生物学技术的发展，微生物的研究呈现出快速发展的趋势，尤其是医学微生物和食品微生物学。关于根际微生物之间的相互作用有了进一步的了解，对于植物生长的促进和保护具有深远的意义。现在国内外关于土壤根际微生物的关系的研究虽然广泛，但还不够完善。但在这一领域，一些新的技术的开发应用，在根际微生物的应用研究在不久的将来肯定会取得更大的进步。
参考文献
[1]郑卓杰.中国食用豆类学[M].北京：中国农业出版社，1997：103.
[2]李阜棣，胡正嘉.微生物学[M].第5版.北京：中国农业出版社，2000：7.
[3]陈宏字，李晓鸣，王敬国.抗病性不同大豆品系根面及根际微生物区系的变化II.连作大豆（重茬）根面及根际微生物区系的变化[J].植物营养与肥料学报，2006，12（1）：104-108.
[4]王从彦，曹震，王磊，等.豆科植物对根际土壤微生物种群及代谢的影响[J].生态环境学报，2013， 22（1）：85-89.
（责任编辑：刘昀）