摘要：以二年生金叶紫穗槐（Amorpha fruticosa L. cv. Jinye）和紫穗槐（对照）枝条为对象，分别测定自然降温下叶片的电导率和丙二醛、可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸的含量以及人工低温下的SOD、POD、CAT活性的变化，探讨金叶紫穗槐在低温条件下的适应能力。结果表明，随着自然温度的降低，金叶紫穗槐的丙二醛含量低于对照；渗透调节物质可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量升高，比对照有更强的低温耐受能力；SOD、POD、CAT活性持续升高，高于对照，抵御低温的能力优于对照。不过金叶紫穗槐的相对电导率与对照的差异不显著。
关键词：金叶紫穗槐（Amorpha fruticosa L. cv. Jinye）；低温；渗透调节；抗氧化酶
中图分类号：S793.2+78 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）18-3492-05
DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.18.025
Abstract： Taking 2-year-old Amorpha fruticosa L. cv. Jinye and A. fruticosa （control） as the research object，relative conductivity，MDA，soluble sugar，soluble protein and proline were measured separately during natural drop in temperature. SOD，POD，CAT were measured separately under artificial low temperature to explore A. fruticosa cv. Jinye adaptability under low temperature. The results showed that with the decreasing of natural temperature，MDA content of A. fruticosa cv. Jinye was lower than that of control； the content of soluble sugar，soluble protein and proline increased，showing strong low temperature tolerance ability than that of control. The activity of SOD，POD and CAT continuously elevated，which were obviously higher than those in the control， the low temperature resisting ability was superior to the control. The relative conductivity of A. fruticosa cv. Jinye was not significantly different to that of control.
Key words： Amorpha fruticosa L. cv. Jinye； low temperature； osmotic adjustment； antioxidant enzyme
紫穗槐（Amorpha fruticosa L.）屬于蝶形花科（Papilionaceae）紫穗槐属（Amorpha L.）多年生落叶丛生灌木；喜光，耐寒、耐旱、耐贫瘠、耐盐碱，适应性强，根系还有根瘤菌，具有固氮能力，是城乡绿化、水土保持的特色树种。金叶紫穗槐（A. fruticosa cv. Jinye）是紫穗槐实生苗的栽培变种，其新梢金黄色，基部黄绿色，一年生冬枝深紫色；春芽金黄色，新展叶金黄色，老叶渐变绿；在北京市是一个良好的乡土彩色观赏树种。国内对紫穗槐的抗寒性研究多集中在栽培、养护等方面，对金叶紫穗槐的抗寒机理研究未见报道。为探讨金叶紫穗槐的低温适应性，试验以紫穗槐为对照，对自然低温条件下的金叶紫穗槐和紫穗槐的枝条叶片丙二醛等渗透调节物质含量及人工低温下抗氧化酶活性、电导率的变化进行了比较，分析了两者之间的差异，以期了解金叶紫穗槐在低温下的适应能力，为金叶紫穗槐的适生区域确认提供理论支持。
1 材料与方法
1.1 材料
试验材料为北京农业职业学院实训基地自然生长的金叶紫穗槐和紫穗槐。在2014年9月，以二年生金叶紫穗槐的幼嫩茎段为外植体进行组织培养。2015年3-4月，选取通过组培的幼嫩枝条50根，将这些枝条分为5组，每组10根，分别浸泡在0、50、100、150、200 mg/kg的ABT1号生根粉稀释液中进行生根，并在之后的一个月内观察、记录其生根情况，比较ABT1号生根粉不同浓度稀释液的最适浓度。当年5月选取约100条组培苗嫩枝，在蘸取生根粉溶液后于遮阳网下实施室外扦插，20 d后移植，移植后一段时间观察光照强弱，若光照强则需加盖遮阳网遮光，生长期间注意排水、除草及病虫害防治。2015年5月底，按照随机原则选取3个采样点，每个采样点选取4～5个枝条进行标记，同时定期观察采样点枝条的长势情况，为比对差异，按上述同样方法选取、标记二年生紫穗槐枝条作为对照。为了便于观察自然降温条件下植物的耐低温能力，在当年10月下旬-11月中旬（此期间房山区正处于由秋天向冬天转换的季节，气温变化幅度明显）每10 d取正常叶片进行生理指标测定，包括丙二醛、可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸的含量，都重复3次。另外，从3个采样点中另外选取叶片分别放于0、-10、-15、-20 ℃的冰箱中，24 h后取出，分别进行超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）3种抗氧化酶活性和电导率的测定。
1.2 测定方法
叶片组织的丙二醛含量采用TBA比色法[1]测定，可溶性糖含量采用硫酸-蒽酮比色法[2]测定，可溶性蛋白含量采用考马斯亮蓝G-250法[2]测定，脯氨酸含量采用酸性茚三酮显色法[3]测定，超氧化物歧化酶活性采用NBT光还原法[2]测定，过氧化物酶活性采用愈创木酚法[2]测定，过氧化氢酶活性采用高锰酸钾滴定法[3]测定，电导率采用电导仪[3]测定。
1.3 数据分析
试验所得数据采用Microsoft Office Excel 2007程序处理，并用其制图；运用SPSS 19.0统计软件进行方差分析和LSD检验。
2 结果与分析
2.1 叶片细胞膜透性相关指标的变化
2.1.1 电导率 金叶紫穗槐和紫穗槐叶片在0、 -10、-15、-20 ℃冰箱中處理24 h后的相对电导率动态情况见图1。从图1可以看出，金叶紫穗槐的相对电导率随着温度的降低而升高，-10、-15、-20 ℃环境下相对电导率分别是0 ℃的1.11倍、1.57倍和1.78倍；从与对照的比较来看，金叶紫穗槐和紫穗槐的相对电导率差异不显著（P>0.05）。
2.1.2 丙二醛 在天气转冷、气温下降的过程中，植物体内受到寒冷的刺激后，细胞膜的过氧化能力在一定范围内会产生波动，这通过丙二醛含量的高低变化可以反映出来；温度过低时，植物组织的自我调节能力承受不起，甚至死亡，导致细胞膜的过氧化防御能力下降；2015年下半年测定的金叶紫穗槐和紫穗槐叶片丙二醛含量情况见图2。从图2可知，金叶紫穗槐和紫穗槐叶片的MDA含量呈上升趋势，对金叶紫穗槐来说，2015年10月25日和11月7日的MDA含量差异较小，仅为11.56%，而11月18日的数值上升较快，与前2个时间点的含量差异分别达到98.15%和77.62%。而在同一时间点上的对照其MDA含量高于金叶紫穗槐。方差分析结果表明，金叶紫穗槐和紫穗槐叶的MDA含量差异显著（P<0.05）。
2.2 叶片渗透调节物质含量的变化
2.2.1 可溶性糖 可溶性糖是植物体内渗透调节物质的一种，在植物受到逆境胁迫时会起到保护作用，其含量变化往往反映植物在逆境中受到伤害的程度[4]；试验测定的金叶紫穗槐和紫穗槐叶片可溶性糖含量情况见图3。从图3可知，随着温度的降低，金叶紫穗槐和紫穗槐叶片的可溶性糖含量随之升高，但上升的幅度两者间存在差别。金叶紫穗槐在2015年11月8日和11月19日的可溶性糖含量分别比10月29日升高16.88%和23.48%；而对照的可溶性糖含量上升的幅度分别达到87.08%和122.72%。另外，金叶紫穗槐在各测定时间点上的可溶性糖含量都高于对照，两者之间多数差异显著（P<0.05）。
2.2.2 可溶性蛋白 在干旱、冷害或冻害条件下，植物体内的可溶性蛋白含量也会随之变化，这一变化是植物对外界环境变化正常的应激反应；作为渗透调节物质，可以在一定程度上提高植物抵抗不良环境的能力[5]；试验测定的金叶紫穗槐和紫穗槐叶片可溶性蛋白含量情况见图4。从图4可见，金叶紫穗槐叶片的可溶性蛋白含量随着温度的降低而升高，在2015年11月8日和11月19日的测定数值分别比10月29日的数值升高0.77倍和1.47倍。金叶紫穗槐在3个时间点测定的可溶性蛋白含量分别高于对照26.25%、17.30%、8.76%，方差分析结果表明，两者之间差异不显著（P>0.05）。
2.2.3 脯氨酸 作为一种有效的渗透调节物质，脯氨酸含量在一定程度上可反映出植物耐逆境胁迫的能力[6]；试验测定的金叶紫穗槐和紫穗槐叶片脯氨酸含量情况见图5。从图5可知，在测定时期内，随着自然温度的降低金叶紫穗槐和紫穗槐的脯氨酸含量都呈现一定程度的升高，金叶紫穗槐在2015年11月8日、11月19日的脯氨酸含量同10月29日相比，分别升高了98.83%和131.53%，并且分别比对照高出了44.01%和25.03%，2个时间点处理与对照两者之间差异显著（P<0.05）。
2.3 抗氧化酶活性的变化
2.3.1 超氧化物歧化酶 试验测定的金叶紫穗槐和紫穗槐叶片SOD活性变化情况见图6。从图6可见，在低温胁迫过程中，金叶紫穗槐的SOD活性随着温度的降低呈现上升的趋势，从数值上看，在-10、-15、-20 ℃下的SOD活性分别比0 ℃的升高了63.23%、92.77%和120.89%，而对照在-10、-15、-20 ℃下的SOD活性分别比0 ℃的升高了119.34%、164.45%和219.50%；方差分析结果显示，金叶紫穗槐和紫穗槐叶片间的SOD活性差异显著（P<0.05）。
2.3.2 过氧化物酶 试验测定的金叶紫穗槐和紫穗槐叶片POD活性变化情况见图7。从图7可见，低温胁迫使金叶紫穗槐叶片内的POD活性升高，随着温度的持续降低，与0 ℃下测定的POD活性相比，其他温度下测定的POD活性上升的幅度在28.86%～63.69%，并与对照间差异显著（P<0.05），对照的POD活性上升幅度在43.93%～110.51%。
2.3.3 过氧化氢酶 试验测定的金叶紫穗槐和紫穗槐叶片CAT活性变化情况见图8。从图8可见，随着温度的降低，金叶紫穗槐叶片的CAT活性升高，但升高的幅度在不同温度区间表现不同，-10 ℃下测定的CAT活性比0 ℃的高出39.48%，-15 ℃下测定的CAT活性比-10 ℃的高出153.45%，-20 ℃下测定的CAT活性比-15 ℃的高出29.51%，CAT活性上升的速度表现为慢-快-慢的特点。与对照相比，金叶紫穗槐在-15、-20 ℃下的CAT活性略高，但与对照差异不显著（P>0.05）。
3 小结与讨论
丙二醛可以反映植物内膜脂过氧化程度的高低[7]，随着丙二醛含量的升高，细胞膜受伤害的程度也在加重[8，9]。试验结果表明，随着自然温度的降低，金叶紫穗槐和紫穗槐的丙二醛含量都随之升高，不过金叶紫穗槐的丙二醛含量在低水平徘徊，这可能是由于在试验期间温度小幅下降，植物体内自身保护能力增强，生成了一些活性物质，这对丙二醛的产生起到了抑制作用所致[10]。但随着温度的继续下降，金叶紫穗槐和紫穗槐的丙二醛含量是否继续升高尚需下一步探寻。
可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸作为渗透调节物质，在低温甚至严寒条件下对提高植物的抗寒能力具有协同作用。众多研究表明，可溶性糖可以提高细胞的渗透能力、降低水势、降低细胞内液体的冰点；可溶性蛋白作为保水剂，能保证水分聚合，防止水分丧失；脯氨酸则能够维持细胞的水分平衡[11]；通过三者含量的升高或降低可以反映植物的抗寒能力强弱。刘杜玲等[12]、申晓慧等[13]、李叶云等[14]分别对遭受低温胁迫后的早实核桃（Juglans regia L.）、紫花苜蓿（Medicago sativa L.）和茶树[Camellia sinensis（L.）O. Ktze.]进行了比较，发现随着温度的降低，可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸的含量变化一致，都有一定程度的升高，并且这种变化反映在抗寒能力较强的供试品种上。也有学者对脯氨酸在抗寒效应方面提出异议，认为脯氨酸作为一项抗寒性指标，仅反映植物的抗寒能力，却不能反映植物在自然条件下的受冻害程度[15]。本试验结果表明，金叶紫穗槐在低温条件下，可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸含量相应升高，表现出一定的抵御寒冷能力，在低温的应激反应表现上，比紫穗槐具有更强的耐受能力。
植物的生长具有规律性，从新生到衰老，生命体自身进行着复杂的生理循环，受外界环境的影响随之产生很强的抵御高温、冷害、盐渍、污染等方面的能力。氧化还原反应是植物代谢过程中不可或缺的，其产生的氧可供给生命体自身的循环，但产生的代谢副产物活性氧物质包括超氧阴离子（O2·-）、过氧化氢（H2O2）、羟自由基（·OH）等却具有毒害作用，这对植物的生命活动构成威胁。SOD作为细胞中广泛存在的酶，在植物受到上述伤害时，会将O2·-转化为H2O2，之后由POD和CAT将之最终转化为H2O，以保护细胞免受毒害[16，17]。有学者发现，在抵御逆境伤害时，SOD、POD、CAT活性协同发挥作用，其数值的升高可以作为抗性的鉴定指标。随着逆境在一定程度的发生，3种酶活性相应升高，但是会达到一个峰值，随着伤害的继续加剧，植物组织细胞受损过重而无法修复，形成不可逆的伤害，此时的SOD、POD、CAT活性则会降低[18-20]。但也有研究者发现，SOD、CAT活性与抗性关联度不高，仅POD活性可作为评价植物抗逆性的指标[21]。本试验表明，随着温度的降低，金叶紫穗槐的SOD、POD、CAT活性持续升高，但变化的趋势在下降的不同温度间存在差别，0～-10 ℃上升缓慢，-10 ℃之后上升迅速；随着温度的进一步下降，又表現出上升平缓的趋势，有耐较低温度的能力。另外，2016年10月23日和10月26日北京市出现2次近30年的单日绝对最低温度（-10 ℃），但通过野外观察，金叶紫穗槐没有出现低温冻害现象，表明金叶紫穗槐具有较强的抗寒能力。试验里随着温度的降低，金叶紫穗槐的SOD、POD、CAT活性高于紫穗槐，可见，在低温胁迫的耐寒性方面，金叶紫穗槐强于紫穗槐。
相对电导率反映植物在低温下细胞膜渗透性的改变甚至破坏的程度，常用于低温下抗寒性分析[22]，低温使抗寒能力弱的植物细胞外渗物质增多，细胞受损严重，相对电导率表现升高[23]。试验发现，随着温度的降低，金叶紫穗槐、紫穗槐的相对电导率都在增加，与常规的研究一致[24]，其中紫穗槐在-10 ℃和-15 ℃的相对电导率偏高，但与金叶紫穗槐的差别不大。
一种植物的抗寒性强弱、适不适合在某地区种植，除了从生理上对其比较外，还要观察其生长过程中的外在表现，比如分枝、发芽、开花、结果等以及各种综合因素的影响。因此要通过各种相关因素的分析来评价其生长的优劣、长势的好坏及抗性的强弱，试验只比较了金叶紫穗槐在某一段低温条件下生理指标的相应变化，旨在讨论其抗寒适应性。下一步可以从低温到高温的转换方面继续探讨其恢复生长情况，希望通过多年的连续试验，并结合栽培管理，真正了解金叶紫穗槐生长的最佳适应条件，为本地区彩叶树种的繁育、养护及栽培管理提供理论支撑。
参考文献：
[1] 杨 晴，郭守华.植物生理生化实验[M].北京：中国农业科学技术出版社，2010.
[2] 中国科学院上海植物生理研究所.现代植物生理学实验指南[M].北京：科学出版社，2004.
[3] 王学奎.植物生理生化实验原理和技术[M].北京：高等教育出版社，2015.
[4] 陈丽丽，蔺 芳，张家洋.温度骤变对5种北方常绿植物抗寒性生理指标的影响[J].西部林业科学，2016，45（2）：94-98.
[5] 王 宁，袁美丽，丁 博.低温胁迫对两种樟树抗寒性生理的影响[J].山东农业大学学报（自然科学版），2016，47（1）：37-42.
[6] 曾 雯，金晓玲，邢 文，等.9个常绿杂交冬青的抗寒能力比较[J].植物生理学报，2016，52（1）：55-61.
[7] 高京草，王慧霞，李西选.可溶性蛋白、丙二醛含量与枣树枝条抗寒性的关系研究[J].北方园艺，2010（23）：18-20.
[8] 林 艳，郭伟珍，徐振华，等.大叶女贞抗寒性及冬季叶片丙二醛和可溶性糖含量的变化[J].中国农学通报，2012，28（25）：68-72.
[9] 石进朝，李桂伶，陈秀新，等.长绿期金银木耐寒生理机制研究[J].西北植物学报，2009，29（1）：111-115.
[10] 魏秀清，许 玲，章希娟，等.莲雾对低温胁迫的生理响应及抗寒性分析[J].果树学报，2016，33（1）：73-80.
[11] 杨玉珍，陈 刚，彭方仁，等.低温胁迫下不同种源香椿含水量和渗透调节物质含量差异及其与抗寒性的相关性[J].植物资源与环境学报，2014，23（4）：47-54.
[12] 刘杜玲，张博勇，孙红梅，等.早实核桃不同品种抗寒性综合评价[J].园艺学报，2015，42（3）：545-553.
[13] 申晓慧，姜 成，冯 鹏，等.6种紫花苜蓿越冬前后几个抗寒生理指标变化研究[J].农学学报，2015，5（12）：94-98.
[14] 李叶云，舒锡婷，周月琴，等.自然越冬过程中3个茶树品种的生理特性变化及抗寒性评价[J].植物资源与环境学报，2014， 23（3）：52-58.
[15] 裴 文，李 鹏，裴海潮，等.低温条件下9种木兰科植物抗寒性研究[J].河南农业科学，2014，43（4）：101-105.
[16] 董 亮，何永志，王远亮，等.超氧化物歧化酶（SOD）的应用研究进展[J].中国农业科技导报，2013，15（5）：53-58.
[17] 梁艳荣，胡晓红，张颖力，等.植物过氧化物酶生理功能研究进展[J].内蒙古农业大学学报，2003，24（2）：110-113.
[18] 陈 荀，王春雷，彭宏梅，等.低温胁迫下黄花丁香的抗寒性研究[J].东北师大学报（自然科学版），2014，46（4）：122-129.
[19] 张 捷，杨淑梅，王 玲.低温胁迫下两个“竹柳”品系的抗寒性[J].林业科学，2013，49（9）：158-164.
[20] 方小平，李昌艳，胡光平.贵州4种木兰科植物幼苗的抗寒性研究[J].林业科学研究，2010，23（6）：862-865.
[21] 黄海涛，余继忠，王贤波，等.不同抗寒性茶树品种秋季新梢的生理特性研究[J].浙江农业学报，2014，26（4）：925-928.
[22] 王红亮，陈丽丽.低温胁迫对9种绿化树木相对电导率的影响[J].江苏农业科学，2013，41（4）：167-169.
[23] 陈 钰，郭爱华，姚月俊，等.低温胁迫下杏花器官内POD、相对电导率和可溶性蛋白含量的变化[J].山西农业科学，2007， 35（3）：30-32.
[24] 仲 强，康 蒙，郭 明，等.浙江天童常绿木本植物的叶片相对电导率及抗寒性[J].华东师范大学学报（自然科学版），2011（4）：45-52.