【摘 要】目的：建立激素性股骨头缺血性坏死动物模型，观察比较造模过程中动物血浆中血小板a颗粒膜蛋白（GMP-140）的含量变化，探讨激素性股骨头坏死的机制，为临床治疗提供理论依据。方法：18只中国白兔，随机分为造模组和对照组，造模组12只，对照组6只。造模组动物注射内毒素（LPS），24h后重复给药1次；在第二次注射内毒素后，立即臀肌注射甲泼尼龙琥珀酸钠（MP），共3次，每次间隔24 h。对照组相应时间点给予生理盐水注射。对照组和造模组于最后一次给药后第1、2、4、6周末，随机抽取6只动物进行空腹采血，待测血浆中血小板a颗粒膜蛋白（GMP-140）的含量。两组在最后一次给药后第6周，各组随机抽取2只兔，行双侧股骨头X线检查，检查后处死，取股骨头观察。结果：造模组2只兔在第二次注射内毒素后死亡。造模组动物血浆中血小板a颗粒膜蛋白（GMP-140）的水平高于对照组（p﹤0.001）。结论：采用小剂量内毒素+大剂量激素的方法可成功制作兔激素性股骨头缺血性坏死模型。血浆中血小板a颗粒膜蛋白（GMP-140）的含量的变化与激素性股骨头坏死的发生相关。血浆中GMP-140的含量的测定可能成为预测激素性股骨头坏死的新方法。
【关键词】激素性股骨头坏死；激素
【中图分类号】R68 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2013）04-0579-02
激素性股骨头坏死（osteonecrosis of femoral head，ONFH）发病率呈逐年增高趋势，但目前临床上还没有一种有效的、公认的治疗方法。因其病因多样，机理不清而成为骨科疑难病之一。本实验通过制作激素性股骨头坏死动物模型和观察比较造模过程中动物血浆中血小板a颗粒膜蛋白（GMP-140）的含量变化，探讨激素性股骨头坏死的机制，为临床治疗提供理论依据。
材料和方法
一.实验动物：选取成年中国白兔18只，体重2.5-3.5kg，雌雄不限。由山西医科大学动物室提供。相同条件下颗粒饲料喂养，单笼饲养，室内保持良好通风。
二.试剂及主要设备：大肠杆菌脂多糖（LPS）（Sigrna公司生产，进口分装）甲泼尼龙琥珀酸钠（MP）（辉瑞公司生产）10%水合氯醛溶液（山西医科大学实验室）10%（体积分数）中性甲醛溶液（0.1 mol/L，pH=7.4） （山西医科大学实验室）GMP-140分析试剂盒（上海西唐生物科技有限公司）
三.动物分组、造模：
动物适应性喂养1周后，随机分为对照组和造模组，对照组6只，造模组12只，精确称重。参考Yamamoto的方法进行改进[1]，采用小剂量内毒素+大剂量激素的方法制作兔激素性股骨头缺血性坏死模型。将造模组动物于耳缘静脉注射内毒素（10μg/kg），24h后重复给药1次；在第二次注射大肠杆菌内毒素后，立即臀肌注射甲泼尼龙琥珀酸钠（40mg/kg），共3次，每次间隔24 h（每次给药前均测量体重，调整剂量）；注射激素后给予青霉素20万单位/kg臀肌注射，预防感染。对照组于相同时间点注射等量生理盐水，同时给予青霉素20万单位/kg臀肌注射。两组动物给予相同的饲养方式。对照组和造模组于最后一次给药后第1、2、4、6周末，随机抽取6只动物进行空腹采血，对照组于相同时间点采血，待测生化指标。两组在最后一次给药后第6周，各组随机抽取2只兔，麻醉后行双侧股骨头X线检查，检查后处死动物，严格无菌手术下取双侧股骨头，对股骨头的外观和冠状面剖面进行观察，确定股骨头坏死模型是否制作成功。
2.观察项目：
2.1 股骨头大体观察：先观察股骨头的颜色、光泽、外型、软骨的色泽。后沿中心冠状面剖成两半，观察剖面的颜色、光泽、坏死区域大小。
2.2 X线检查：动物麻醉后，行双侧股骨头X线检查，确定股骨头坏死模型是否制作成功。
2.3 血液标本采集和生化指标检测：对照组和造模组于最后一次给药后第1、2、4、6周末，随机抽取6只动物，禁食、水12h后，抽取耳缘静脉血3ml，缓慢加人含有200ul20%EDTA-Na2的试管中，离心处理（3000r/min，离心10min），取上层血浆，置于-80℃冰箱保存。
3.统计学方法：所有实验数据以均数±标准差表示，两组血浆中GMP-140的含量比较应用重复测量方差分析，P值<0.001为差异有统计学意义。
三、结果：
讨论
寻找接近临床的激素性股骨头缺血坏死的造模方法一直是激素性股骨头坏死的研究热点。人们通过采用单纯激素造模法[2]、血清加激素造模法[3]和内毒素加激素造模法[1]3种不同的方法，使用不同剂量和种类激素，进行激素性股骨头缺血坏死模型的制作，最终发现采用内毒素加激素造模法制作兔激素性股骨头缺血坏死模型比较理想，需要解决的问题是降低动物死亡率。
血小板a颗粒膜蛋白（GMP-140）是一种单链跨膜糖蛋白。研究已证实：GMP -140是活化血小板的特异性分子标志物，不仅反映血小板活化程度及功能状态，还介导血小板与中性粒细胞及内皮细胞的黏附功能。同时，它能够加固并机化血栓，加重缺血后再灌注损伤[4]。GMP-140在静息血小板中分布在血小板α-颗粒上，当血小板被活化时，血小板发生黏附聚集，随后发生血小板颗粒内容物释放，α-颗粒与胞浆膜融合，GMP-140便可通过颗粒膜的融合过程，重新分布至管道系统及胞浆，并随即均匀分布于胞浆膜表面，在血小板破坏时被释放入血。根据GMP-140这一特点，可通过测定血浆中GMP-140的含量判断血小板是否活化，所以GMP-140可作为血小板活化程度和血栓形成的标志物。关于激素性股骨头缺血坏死的发病机制的学说中，血管内凝血和前凝血状态学说为多数学者认可，因而从理论上讲，激素性股骨头缺血坏死发生时，血浆中GMP-140的含量是升高的。本实验在制作兔激素性股骨头缺血坏死模型过程中，检测发现兔血浆中血小板a颗粒膜蛋白（GMP-140）含量升高，可能是由于内毒素与激素协同作用使兔机体内形成血栓前状态，致使血小板活化，引起血浆中GMP-140含量升高。同时说明，激素性股骨头缺血坏死发生时，机体内存在血管内凝血和前凝血状态。
通过本实验尚可认为采用小剂量内毒素（10μg/kg，连续2次）+大剂量激素（40mg/kg，连续3次）的方法制作兔激素性股骨头缺血性坏死模型，成功率较高，死亡率较低。同时，由于血小板a颗粒膜蛋白（GMP-140）在造模过程中的变化推测其测定可能成为预测激素性股骨头坏死的新方法。但是，本实验中实验动物例数较少，存在局限性，关于激素性股骨头缺血性坏死模型的制作方法和血小板a颗粒膜蛋白（GMP-140）与激素性股骨头缺血性坏死的关系仍需进一步研究。
参考文献：
[1] Yamamoto T，Hirano K，Tsutsui H，et al.Corticosteroid enhances theexperimental induction of osteonecrosis in rabbits with Shwartzman reaction.ClinOrthop Relat Res，1995，316：235-243
[2] 王坤正，毛履真，胡长根，等.激素性股骨头坏死发病机制的实验研究
[3] Matsui M，Saito S，Ohzono K，et al.Experimental steroid-inducedosteon ecrosis in adult rabbits with hypersensitivity vasculitis.Clin Orthop Relat Res，1992，277：61-72
[4] Jerome S N， DoreM， Paulson J C， et a.l P- selection and ICAM-1dependentadherence reactions：Role in the genesis ofpost-ischem icnoreflow[J]. JAm J Physio，l 1994， 266： 1316