摘要 [目的]研究棉花中SVP类基因的功能。[方法]通过同源克隆的方法在陆地棉中棉所36中克隆SVP的同源基因GhMADS29，对其进行Blast搜索比对和进化树分析以及荧光定量的表达模式分析。[结果]GhMADS29与猕猴桃的SVP4基因相似度最高，其cDNA序列含有9个外显子、8个内含子，不同时期顶芽的荧光定量结果表明它在花芽分化起始期的花芽中表达量最高，且不同组织的荧光定量分析表明它在叶片和顶芽中表达量较高。[结论]首次获得棉花SVP亚族基因，命名为GhMADS29，其GeneBank登录号为JQ682642。
关键词 SVP；荧光定量；开花
中图分类号 S562 文献标识码
A 文章编号 0517-6611（2015）15-028-04
Molecular Cloning and Expression Analysis of SVPlike Gene，GhMADS29 from Gossypium hirsutum L.
ZHANG Wenxiang1，2，PANG Chaoyou1，FAN Shuli1，YU Shuxun1* et al
（1.Cotton Research Institute，Chinese Academy of Agriculture Sciences，Anyang，Henan 455000； 2.School of Chemistry and Life Science，Guizhou Normal University，Guiyang，Guizhou 550018）
Abstract [Objective] To study SVP gene from cotton.[Method] The SVP homologue gene GhMADS29 was cloned from CCRI 36 upland cotton by homology cloning strategy.Blast alignment，phylogenetic tree and quantitative RTPCR were conducted to analyze GhMADS29.[Result] It was showed that GhMADS29 was most similar to SVP4 from kiwifruit and that GhMADS29 had nine exons and eight introns.GhMADS29 expressed highest in 2SAM （shoot apical meristems at the second true leaf expanded stage） at which stage flower bud initiated differentiation.Expression analysis in different tissues showed that GhMADS29 expressed very highly in leaves and apical buds.[Conclusion] GhMADS29 is belong to SVP subfamily obtained for the first time in cotton and the accession number is JQ682642.
Key words SVP； Quantitative RTPCR； Flowering
擬南芥中的SVP和AGL24都属于STMADS11亚族，它们序列高度保守，在花器官分生组织决定方面具有相同的功能，但在控制开花时间的功能上却是相反的：AGL24是开花促进因子[1-2]，而SVP却是开花抑制因子[3]。svp突变体通过缩短营养生长阶段促进了开花[3]，研究表明SVP是开花温度途径中一个很重要的调节因子，它会调节开花促进因子miRNA172在不同温度的表达水平[4]。水稻的STMADS11亚族基因OsMADS55在野生型拟南芥中过表达后，会使拟南芥开花时间推迟，花发育也发生改变，而另一该亚族的基因OsMADS22在拟南芥中过表达后，却不会影响开花时间，只是花器官发生变异。但这2个基因都不能回复svp和agl24突变体的表型[5]。
短季棉是指生育期较短的陆地棉品种，是随着生态环境与农业种植制度的变化，与一定的社会经济条件、生产发展水平、科学技术发展水平相适应逐步形成发展起来的[6]。棉花的早熟性与多个农艺性状有关，如株高、第一果枝节位、苗期、蕾期、花期、铃期、开花纵间隔期、横间隔期等[7]，而且随着科学的发展进步，分子育种成为当前的热点，因此笔者根据其他作物中已有功能验证的且确定具有调控开花时间功能的MADS基因，确定SVP类基因为研究对象，以期能够明确这些基因的功能，从而为短季棉培育提供良好的基因资源。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料。以棉花早熟品种中棉所36为试验材料，种植于中国农业科学院棉花研究所老所部试验田，按大田常规管理办法进行管理。分别取子叶展平（OSAM）、第一真叶展平（1SAM）、第二真叶展平（2SAM）、第三真叶展平（3SAM）时的顶芽，以及盛花期的顶芽、根、茎、叶、苞片、萼片、花瓣、雄蕊、心皮、开花后10 d的胚珠和纤维。所取材料立即投入液氮中冷冻，然后于-70 ℃冰箱保存备用。
1.1.2 主要试剂。大肠杆菌DH5α感受态细胞购自北京天根公司，农杆菌LBA4404为中国农业科学院棉花研究所早熟课题组保存；培养基中的酵母粉、蛋白胨和琼脂粉购自Oxoid公司；pGEMT easy克隆载体购自Promega公司，常规生化试剂，如Taq DNA聚合酶、限制性内切酶等，均购自大连宝生物工程公司；RNA提取试剂盒购自北京天根公司；反转录试剂盒购自美国Invitrogen生物技术有限公司；胶回收及DNA提取试剂盒购自上海生物工程公司；质粒提取试剂盒购自Omega生物技术公司。
1.1.3 主要仪器。PCR仪、电泳仪、超净工作台、紫外凝胶成像系统、DU800核酸蛋白分析仪、自动蒸汽消毒锅、超低温冰箱、高速冷冻离心机、冷冻台式离心机等。
1.2 方法
1.2.1 棉花RNA的提取。按照北京天根公司的RNA提取试剂盒操作说明进行。
1.2.2 引物设计与基因克隆。以拟南芥SVP和AGL24基因为参考序列，Blast搜索棉花的EST数据库（NCBI棉花 EST数据库网址：http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nucest/？term=cottonTIGR棉花 EST数据库网址：http：//compbio.dfci.harvard.edu/cgibin/tgi/cat_download.pl？db=cottest），将得到的EST进行拼接，得到含有完整阅读框的cDNA序列，根据此序列设计引物，引物需包含完整的开放阅读框（ORF），引物序列：29F：5′ ACCTCACTTCTTCACACTTTCTTCC3′，29R：5′ TCTTCGCAACATCACCGCCTTTTAACC3′。
根据大连宝生物公司Taq DNA聚合酶说明书配制PCR反应体系，总体积为25.00 μl， 其中ExTaq酶0.15 μl，10×ExTaq Buffer 2.50 μl，10 mmol/L dNTP mixture 2.00 μl，引物（20 μmol/L）各1.00 μl，模板2.00 μl。PCR扩增程序：95 ℃预变性 4 min；95 ℃变性 45 s，54 ℃退火 40 s，72 ℃延伸50 s，33个循环；72 ℃延伸 5 min。
1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，以天根公司的MarkerIII为参照，若条带大小与预期结果相近，则回收目的片段，送金唯智公司测序。
1.2.3 荧光定量PCR。参照Roche公司的FastStart Universal SYBR Green Master试剂盒说明书和ABI （Applied Biosystems）公司的ABI 7500荧光定量PCR仪进行。以GhACTIN （GenBank：AY305733）作为内参，以控制误差。荧光定量引物序列：Q29F：5′GCATCGACAGATCGGTCACCAG3′；Q29R：5′CGTCTCAAGCCTCCTTCAACTA3′。actinF：5′ATCCTCCGTCTTGACCTTG3′；actinR：5′ TGTCCGTCAGGCAACTCAT3′。
PCR反应体系总体积25.0 μl ，其中SYBR Green PCR Master mix 12.5 μl，上下游引物各0.5 μl，cDNA 模板 2.0 μl。反应程序：50 ℃預变性2.0 min；95 ℃变性10 min，95 ℃退火10 s，65 ℃延伸30 s，40个循环；72 ℃延伸35 s。
2 结果与分析
2.1 GhMADS29基因的获得
利用拟南芥SVP和AGL24的核酸序列Blast棉花EST数据库，将得到的EST序列
通过CAP3在线拼接软件进行拼接，根据拼接得到的序列设计引物，保证所设计引物跨越完整的ORF，以中棉所36的cDNA为模板进行扩增（图1），回收目的条带，连接到pGEMT Easy
载体，转化大肠杆菌，通过蓝白斑筛选和PCR鉴定为阳性的克隆，送公司测序，确定序列后，将序列提交到GeneBank数据库，获得登录号JQ682642。
2.2 GhMADS29的序列分析
利用NCBI的ORF finder在线工具对其蛋白序列进行预测，发现其编码228个氨基酸。用预测的蛋白序列Blast NCBI的数据库，结果显示GhMADS29与猕猴桃的SVP4相似度最高，一致性达到60%，由此猜测GhMADS29属于SVP亚族（STMADS11亚族）。将GhMADS29与其他一些作物的SVP类基因进行序列比对，发现所预测的GhMADS29的蛋白序列在N末端比其他SVP基因都多出8个氨基酸（图2），进一步分析核酸序列发现，得到的cDNA序列中包含2个ATG起始密码子，且两者之间的碱基数正好是3的倍数。将这些序列进行进化树分析，同样发现GhMADS29属于STMADS11亚族，但聚类关系不是很近（图3）。
用所得到的cDNA序列Blast雷蒙德氏棉的基因组序列，分析GhMADS29的基因结构。发现所得到的这段cDNA序列所对应的基因组序列含有9个外显子、8个内含子（图4），而且第一个起始密码子位于第一个外显子，第二个起始密码子位于第二个外显子，基因组全长11 466 bp。
2.3 GhMADS29的表达模式 由图5A可知，在2SAM（第二片真叶展平）的花芽分化时期，GhMADS29的表达量最高，随后的3SAM（第三片真叶展平）时期表达量也较高，但相比于2SAM，3SAM时期的表达量又有所下降。对GhMADS29进行不同组织的表达模式分析（图5B），发现其在叶片中的表达量最高，顶芽次之，各个花器官中的表达量都较低，只有苞片和心皮相对较高。 GA处理后的表达分析发现（图6），GhMADS29的表达量下降。
3 结论与讨论
该研究以拟南芥中的SVP和AGL24基因为参考序列，Blast棉花EST数据库后，通过EST拼接得到了GhMADS29的序列，与拟南芥SVP和AGL24序列比对发现，GhMADS29与SVP相似性更高，由此猜测GhMADS29可能与SVP具有相似的功能。
不同时期顶芽的表达模式分析发现，GhMADS29在二叶展平时期顶芽中表达量最高，推断它可能与花芽的起始分化有关，不同组织的表达模式分析发现，GhMADS29在叶片中的表达量最高，顶芽次之，而且对棉花进行GA处理，也发现GhMADS29的表达量下降，因此猜测GhMADS29可能通过叶片和顶芽感受信号后表达量上调进而促进花芽分化且它可能与拟南芥SVP的作用模式相同，因为研究表明拟南芥SVP在叶片中与FLC形成二聚体调控SOC1和FT的表达[8]，进而调控植物开花，而且在感受到自主途径、温度途径、GA途
径的信号后，SVP在顶芽中的表达量下调[3，8-9]。通过不同组织的表达模式分析发现，GhMADS29在花器官中的表达量相对较低，因此猜测GhMADS29可能不参与花器官发育的调控。
该研究通过同源克隆的方法克隆到陆地棉中SVP类基因的完整开放阅读框，命名为GhMADS29，并提交到GeneBank获得登录号为JQ682642。其在第二片真叶展平时表达量最高，且GA会抑制其表达。
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