谢振蕊，李 丽，周明艳，张俊清，2，李海龙，2
（1.海南医学院药学院 海南省热带药用植物研究开发重点实验室，海南 海口 571101；
2.海南医学院 药学院，海南 海口571199）
糖尿病胃轻瘫（diabetic gastroparesis，DGP）是一种胃上部、胃窦体、幽门下括约肌和十二指肠无机械梗阻的胃蠕动加速或胃排空障碍的并发症，主要以胃平滑肌运动异常、胃排空迟缓、胃电节律失调的为特点，以早饱、腹胀、呕吐、上腹痛、血糖控制不良等为表征［1，2］。据统计，胃轻瘫在1 型糖尿病患者的发病率约5.3%，肥胖2 型糖尿病达1.1%，其中女性患者占比约达4/5，存在性别差异［3-5］。虽然糖尿病胃轻瘫是一种严重影响患者生活质量的健康问题，但胃轻瘫的发病分子机理尚不清楚。迄今，海内外学者对于DGP 的研究认为，机体血糖失调、氧化应激受损、胃肠神经异常、Cajal 间质细胞（ICC）丢失等与DGP 的发病密切相关［6-9］。因此，临床 上 主 要 采 取 血 糖 维 系［10］、药 物 治 疗［11］、胃 电 刺激［12］、手术治疗［13］和饮食控制［14］等方式控制DGP 病情的发展，其中药物治疗因为相对安全且便捷常常作为首选。然而，常用的西药多潘立酮、胃复安和西沙必利由于不良反应和快速耐受性而导致使用受限［15，16］。而疗效温和的中药在多种病症中的应用潜力巨大，越来越受到重视。
高良姜Alpinia officinarum Hance.为姜科的干燥根茎，具有温胃止呕、散寒止痛、脾虚寒疟，健脾胃等功能与糖尿病性胃轻瘫脾胃虚寒（包含脾胃虚弱）的临床表现及主要证型之一相对应。近年来研究表明，高良姜具有抗胃溃疡、止呕、促进胃排空、肠推进、降血糖和胃肠道保护等药理作用［17-20］。广藿香Pogostemon cablin（Blanco）Benth.为唇形科植物，具有化湿、解暑、止呕的作用［21］。据《本草逢原》描述，广藿香在开胃止呕、治腹泻方面具有很好的疗效，且临床上曾使用藿香正气软胶囊治疗DGP［22］。从中医理论出发，高良姜温胃平逆，行气导滞，广藿香芳香化浊，和中止呕，两者均归于脾、胃经，属于相使为用，功效协同、相辅相成，大大增强了益气健脾和胃之效。但尚没有任何确切的证据表明两者合用能有效地改善DGP 的病程。本研究使用网络药理学方法，利用已有数据库，对”高良姜-广藿香”治疗DGP 过程中可能作用的靶点和通路进行大胆预测，为今后的相关研究提供参考。
1.1 高良姜和广藿香活性化合物及靶点筛选
在 中 药 药 理 学 数 据 库（TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）中分别以“高良姜”和“广藿香”为关键词，设置OB≥30%和DL≥0.18 为筛选依据，获得高良姜和广藿香各自的药效化合物及其相应的靶蛋白。通过Uniprot 数据库，设置筛选物种类别，将靶蛋白转换整理为相应的靶基因。
1.2 DGP 相关靶点筛选
在GeneCards 数据库（https：//www.genecards.org）中，以“diabetic gastroparesis”和“delayed gastric emptying”为关键词，以关联系数≥10 为筛选指标，获得DGP 疾病主要靶基因。
1.3 高良姜-广藿香治疗DGP 潜在靶点预测
将“高良姜-广藿香”药主要药效成分靶点和DGP 相应靶基因导入维恩图网站（http：//jvenn.toulouse.inra.fr/app/example.html）中，得到的重合部分即为“高良姜-广藿香”药与DGP 的共同靶基因。
1.4 核心靶点筛选和网络图构建
获得的共同靶基因后导入STRING 软件平台，选择物种“homo sapiens”，最低相互作用评分最高置信度为0.70，其余保持不变，获得蛋白互作数据后导入 Cytoscape 3.8.0 软件中绘制PPI 网络图，并采用CytoNCA 对网络中基因节点度值、介数等进行分析筛选核心靶点。
1.5 GO 与KEGG 通 路 富 集 分 析
下载ClusterProfiler R 功能包对“高良姜-广藿香”与DGP 的共同靶点进行GO 功能分析和KEGG通路富集。获得与“高良姜-广藿香”药防治DGP 的密切相关生物过程（biological process，BP）、细胞组成（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）及信号通路。
2.1 高良姜-广藿香主要药效化合物及作用靶基因
通过TCMSP 数据库查询，得到高良姜主要药效化合物13 个、广藿香11 个，去除重复后，共获得23 个目标成分，其对应靶点97 个。主要药效化合物信息如下表1 所示。
表1“高良姜-广藿香”主要化合物信息Tab 1 Information of main active ingredients a of“A.officinarumand Pogostemonis Herba”
2.2 相关靶点的挖掘及网络图构建
2.2.1 高良姜-广藿香药治疗DGP 靶点的挖掘 从GeneCards 分析平台中筛选出DGP 相关靶基因533个。将其与“高良姜-广藿香”活性化合物对应的靶点通过维恩图找出交集后，得到”高良姜-广藿香”与DGP 的共同靶点46 个。分别为AKR1B1、AR、BCL2、BIRC5、CASP3、CASP8、CASP9、CTSD、CAV1、TP63、CRP、CYP3A4、EGFR、ESR1、ESR2、CCND1、CCNB1、GABRA1、GSTM1、GSTP1、GSK3B、HIF1A、IGF2、IGFBP3、IRF1、IL6、NR3C2、MAPK8、MYC、NQO1、NFE2L2、PPARG、PGR、PTGS1、PRKCA、FOS、RAF1、RASSF1、ERBB2、ERBB3、RB1、RUNX2、CHEK2、PON1、PLAU、VEGFA。韦恩图结果如图1 所示。
图1“高良姜-广藿香”药物和DGP 相关靶点的韦恩图Fig 1 Venn Chart of related targets of active constituents of“A.officinarumand Pogostemonis Herba”and DGP
2.2.2 高良姜-广藿香治疗DGP“药物-活性-靶点”的构建 将收集的共同靶点excel 数据表导入Cytoscape 软件，构建“药物-化合物-靶点”间的网络图。结果如图2 所示。“高良姜-广藿香”的槲皮素、山柰酚和高良姜素成分的靶点最多，可认为是“高良姜-广藿香”治疗DGP 的主要成分。此外，从图中可以看出“高良姜-广藿香”药的多种成分可以作用于同一个靶点，一种成分可以作用于不同的靶点，充分提示了“高良姜-广藿香”药主要通过多成分、多靶点和多通路互作的特点。
图2“高良姜广藿香-活性成分-靶点”网络图Fig 2 Constituent -target-disease-pathway network of“A.officinarumand Pogostemonis Herba”
2.2.3 蛋白互作网络图构建 将“高良姜-广藿香”治疗DGP 的共同靶点互作数据导入Cytoscape 软件绘图并经CytoNCA 分析后得到网络图3 及拓扑节点参数表2。由结果可知，EGFR、CCND1、ESR1、FOS、MAPK8 等邻接节点最多，可能为核心靶点。
2.3 GO 功能富集和 KEGG 通路富集分析
利用R 语言中ClusterProfiler 插件进行共同靶点的GO 功能分析和KGEE 富集。其中GO 功能富集包括BP 相关条目 87 条，主要涉及对药物的处置，对凋亡信号的负调节及对 RNA 酶Ⅱ启动子转录等方面；
CC 相关数目 26 条，位于前列有蛋白磷酸酶结合、细胞因子活性、类固醇结合和转录因子活性等；
MF 相关数目12 条，主要涉及核染色质、线粒体外膜、细胞外空间和核染色质等方面。GO 功能富集结果见图4。
图3“高良姜-广藿香”治疗 DGP 相关 PPI 网络Fig 3 PPI network of common genes of active compounds of“A.officinarum-Pogostemonis Herba”and DGP
图4 高良姜广藿香治疗 DGP 的 GO 功能富集分析图Fig 4 Analysis diagram of GO function enrichment in treatment of DGP by“A.officinarum-Pogostemonis Herba”
表2“高良姜-广藿香”治疗 DGP 的关键靶点信息Tab 2 Key target information of“A.officinarum and Pogostemon cablin”in DGP treatment
“高良姜-广藿香”药治疗DGP 的46 个共同靶点主要富集在 25 条通路上（P＜0.01），主要包括PI3K-AKT、MAPK、Endocrine resistance、Focal adhesion、EGFR tyrosine kinase、Apoptosis and P53 pathway 等炎症或凋亡调控途径。结果见图5。
图5 KEGG 通路富集分析气泡图Fig 5 Bubble chart of KEGG critical pathways with enrichment
糖尿病胃轻瘫系指由胃肠动力障碍引起的胃排空迟缓或胃蠕动加快的临床综合征。胃排空主要是在中枢神经系统调控下，由平滑肌、自主神经系统和特殊的起搏细胞（Cajal 间质细胞）协调完成的，任何一个过程破坏均有可能影响胃排空机制［23，24］。研究提示，在胰岛素抵抗或胰岛素信号传导障碍的患者体内，可发现ICC 细胞数量的减少及形态功能的发生改变，这在DGP 病程中具有重要的影响［25］。此外，高血糖可导致机体一直处于高氧化应激和高炎症状态，正常的抵抗氧化应激机制受损，核转录调控因子Nrf2 及下游抗氧化基因表达降低，nNOS 介导的胃氮松弛受到抑制，Cajal 间质细胞丢失，胃窦动力变差，胃节律失常，加速DGP 发展进程［26-28］。而调控抗氧化通路可以上调HO-1 和Nrf2 的表达，不仅可以保护ICC 细胞免受损害，而且通过维持葡萄糖稳态以及恢复改变的胃nNOS 功能可使胃排空延迟恢复正常，阻碍DGP 发展［28］。
通过对中药数据库的搜索整理，获得”高良姜-广藿香”药对应活性化合物共有97 个靶蛋白，对与DGP 关键靶点有46 个。其中槲皮素、山柰酚和高良姜素等化合物的潜在作用靶点最多。在对高良姜的研究中，程守前等［29，30］发现高良姜提取物能明显降低STZ 与高脂高糖联合诱导的T2DM 大鼠及dbdb 小鼠的空腹血糖，减轻T2DM 诱导的胰腺及肝脏功能的损伤；
Thrush 等［31］研究提示，槲皮素能够抑制TNF-α 和iNOS 表达水平的上调，恢复棕榈酸盐处理的L6 肌管葡萄糖摄取的降低；
Kim 等［32］进一步研究发现，槲皮素能够减少高脂喂养肥胖小鼠骨骼肌中巨噬细胞的积累和炎症因子（如TNF-α 和MCP-1）的 水 平，以 及MAFbx/atrogin1 和MuRF1 mRNA 的表达，而胰岛素抵抗与肥胖患者骨骼肌炎症及萎缩密切相关，提示槲皮素可以通过抑制骨骼肌炎症介质和巨噬细胞浸润来保护肥胖相关的骨骼肌萎缩，从而改善胰岛素抵抗，降低机体血糖。Hana 等人［33］发现口服山奈酚可以通过抑制丙酮酸羧化酶（PC）和G6Pase 表达活性抑制肝糖异生及增加Akt 和GCK（葡萄糖激酶）的活性来改善肝脏葡萄糖代谢，缓解高脂高糖饮食诱导的肥胖小鼠的空腹高血糖、葡萄糖耐受不良和胰岛素抵抗；
张茁等［34］通 过 建 立 自 发 性2 型 糖 尿 病KKAY 小 鼠 动 物模型提示，山柰酚可能通过介导骨骼肌PI3K-AKT-GLUT4 信号途径，缓解小鼠血糖耐受及体重，改善胰岛素抵抗；
Abukhalil 等［35］在高良姜素对糖尿病大鼠的心脏保护作用发现，高良姜素能够改善糖尿病大鼠的高血糖、血脂异常和心功能指标，阻止组织病理学改变。故而，结合相关研究及此次结果预测，“高良姜-广藿香”药治疗 DGP 胃排空异常的可能与“高良姜-广藿香”药通过降低机体血糖、改善胰岛素敏感性、调节氧化应激和炎症反应等有关。
利用R 语言预测KEGG 通路，发现“高良姜-广藿 香”药 主 要 可 能 通 过PI3K/Akt、MAPK、p53、ErbB、HIF-1 和IL-17 等 途 径 发 挥 对DGP 的 作 用。其中，PI3K/AKT 通路在张默函等［36］进行的胃轻瘫大鼠胃平滑肌细胞凋亡研究中，被发现PI3K 及P-AKT 的表达会随着机体高血糖的持续刺激呈先增高后下降至正常标准以下的现象，胃平滑肌细胞也从刚开始受到刺激时的自我保护状态转化到抗凋亡功能消失；
此外，PI3K/AKT 通路在高良姜素抗H2O2诱导的氧化损伤研究中，被证实能够被H2O2抑制，导致Bcl-2/Bax 比值降低，诱导细胞凋亡［37］。而张锋利等［38］在桔梗枳壳汤加味的实验结果中表示，激 活PI3K/AKT 通 路，增 加p-PI3K 与p-Akt 的表达水平，能够影响胃肠激素，调控胃肠动力，这对DGP 的 发 展 具 有 重 要 的 作 用；
Barros 等［40-42］研 究 人员发现p38/MAPK 通路在高血糖或糖尿病患者中，能够诱导促炎症介质如iNOS、TNF-a 和IL-1β 的产生，影响胃肠道蠕动障碍，造成糖尿病大鼠胃排空机制障碍；
Thomas 等［43］在科学研究中发现，激活p38/MAPK 通路，可以加快雌激素受体（ER）的转运速度，促使ER 与雌激素反应元件（EREs）结合加快，而在啮齿动物和人类中发现，雌激素对胃排空有重要的作用。这些数据表明，MAPK 通路在胃排空迟缓的发病机制中起着重要作用，被认为是治疗炎症性胃排空障碍的理想靶点。P53 是一种肿瘤抑制蛋白，可调节细胞周期调节、氧化还原稳态、DNA复制与修复、凋亡与自噬、能量代谢等多种维持稳态 的 基 因 表 达［44，45］。Zhang 等［46，47］在AMPK 介 导 高糖条件下大鼠胃平滑肌细胞凋亡的机制研究发现，AMPK 激活触发p53 蛋白活化，诱导促凋亡BAX 因子的表达，抑制Bcl-2 的mRNA 转录，可以影响胃平滑肌细胞凋亡进程，损害胃肠运动机制。
结合以上分析预测结果及相关研究数据，推测”高良姜-广藿香”药防治DGP 主要是通过作用于多个因子及信号通路来发挥作用，为后期“高良姜-广藿香”药治疗DGP 研究提供参考。
作者贡献程度说明：
谢振蕊：提出研究思路、设计研究方案、论文撰写；
李丽：数据库收集数据、分析数据、论文起草；
周明艳：负责数据整理、图片绘制、论文起草；
张俊清：提供研究经费、对论文进行修改指正；
李海龙：提供指导论文撰写、对论文进行修改指正。
所有作者声明不存在利益冲突关系。
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