■刘 卓 牛宏泽 裴世腾 任有蛇 石 磊
(山西农业大学动物科学学院，动物繁殖生物技术实验室，山西太谷 030801)
硒元素是动物维持正常生长发育所必需的微量元素之一，对动物的抗氧化性、繁殖性能、免疫机能等具有重要意义。最早发现硒可以作为有益的微量营养素是在19世纪50年代，一直到1977年在大鼠的血浆中发现了第二种含硒蛋白[1]，5年后又有学者发现该蛋白的硒元素主要以硒代半胱氨酸的形式存在并命名为硒蛋白P（selenoprotein P, SelP）[2]。
硒通过其转运体SelP 将硒从肝脏运输到其他靶组织（如睾丸和大脑）[3]。SelP含有10个硒原子并由2个结构域组成。较大的N端结构域包含1个硒代半胱氨酸残基，3个N-糖基化位点，具有氧化还原的活性；
其他9 个硒代半胱氨酸组成较小的C 端结构域，含有1 个O-糖基化位点，有利于硒的运输[4]。SelP 是一种多功能蛋白，具有酶促活性，在体内硒转运和维持组织硒的稳态中起关键作用[5]。因此，目前血浆/血清中SelP 的浓度被认为是表示硒状态较为可靠和理想的生物标志物[6-7]。Kasik 等[8]研究表明SelP 可由胎盘产生，并与谷胱甘肽过氧化物酶3（glutathione peroxidase 3, GPx3）一起进入母体和胎儿的硒循环。随着妊娠时间的进行，胎盘SelP 表达水平成呈比例增加，胎儿SelP的积累也随着胎盘SelP水平递增，二者均于妊娠末期达到最高水平[9-10]。
近年来，人们发现载脂蛋白E 受体2（apolipoprotein E receptor 2，ApoER-2）是SelP 循环的重要介质。ApoER-2是一种低密度脂蛋白受体，可以与SelP的C末端结构域特异结合，但不与N 端结构域结合[11-12]。ApoER-2 介导的SelP 形式的摄取在许多组织中得到证实。Ulrich 等[13]和May 等[14]研究发现人和小鼠胎盘滋养层细胞中ApoER-2 表达量较高，随后有学者研究表明，胎盘也可能存在与大脑和睾丸类似的SelPApoER2 转运机制[15]。胎盘作为高度特化的妊娠器官，通过连接母体和胎儿的循环来实现气体、营养物质和废物的交换。微量营养素摄入在胎儿生长发育的各个阶段都有着关键作用。近几年的研究表明，微量元素硒的含量会影响母体的繁殖性能和胎儿的生长状况，但硒通过SelP-ApoRE2在胎盘的转运机制尚不清晰。因此，本试验以湖羊妊娠母羊为研究对象，通过在日粮中添加亚硒酸钠，研究SelP 和ApoRE-2在绵羊胎盘中的表达，并通过免疫组化分析技术对湖羊胎盘中SelP 和ApoRE2 进行定位研究，为进一步揭示硒的胎盘转运及硒对胎儿发育的调控机制提供实验依据。
1.1 试验动物与设计
选取体重、体型、年龄、胎次相近的湖羊母羊80 只进行同期发情，通过腹腔镜授精技术进行人工授精，45 d 后使用B 超机妊娠诊断，将怀孕母羊分为两组，一组饲喂基础日粮，另一组整个妊娠期在基础日粮（DM）营养水平上添加0.5 mg/（kg·d）亚硒酸钠进行饲喂，日粮组成及营养水平见表1。饲养方式为舍饲圈养，每日2 次等量饲喂，自由饮水。预试期7 d，正试期150 d。
表1 日粮组成及营养水平（干物质基础）
1.2 样品采集
在母羊产羔后，立即收集母羊产羔后脱落的胎盘，用于免疫组化试验。
1.3 免疫组织化学定位
1.3.1 石蜡切片制作
将母羊胎盘的子叶和血管进行修剪，对组织块进行冲洗，置于固定液中过夜，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，浸蜡；
包埋机包埋后用切片机切成5 μm的组织切片；
37 ℃过夜后烘片机烘6 h。
1.3.2 免疫组化
将组织切片进行二甲苯脱蜡，梯度乙醇除去二甲苯，蒸馏水洗净后用PBS 浸泡；
微波法抗原修复；
切片滴加3% H2O2溶液消除内源性过氧化物酶，滴加50 μL 正常山羊血清（A 液）室温封闭15 min；
滴加武汉爱博泰克生物科技有限公司的一抗工作液50 μL，湿盒中4 ℃冰箱过夜；
滴加生物素标记山羊抗兔IgG（B液）50 μL，37 ℃孵育15 min；
PBS 清洗后滴加辣根酶标记的链霉卵白素（C液）50 μL，37 ℃孵育15 min；
洗涤、滴加二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）工作液进行显色，在显微镜下观察显色反应，在反应出现阳性表达后将切片浸入自来水中终止显色反应；
苏木精复染3～4 min 后使用自来水反蓝10 min；
乙醇梯度脱水后使用二甲苯脱去乙醇；
中性树脂将切片封存；
干燥5 d 后光镜观察、照相；
阴性对照组与阳性组步骤相同，但在一抗反应时，以磷酸盐缓冲液（phosphate-buffered saline，PBS）代替一抗。
1.4 图像采集
将胎盘组织切片免疫组织化学染色后置于Olympus生物显微镜下,每张切片选择随机的5个视野进行5倍、10倍、40倍物镜观察，Olympus DP71图像采集系统采集图像并拍照。用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件测量胎盘滋养层细胞和血管内皮细胞中阳性反应产物分布面积和相应区域的总面积。拍照和测量时尽量保持各参数设置始终一致,以保证测量数据之间的可比性。
1.5 统计分析
本试验所得数据采用IBM SPSS 27.0统计软件对各组数据进行单因素方差分析。
2.1 SelP和ApoER-2的蛋白定位
根据免疫组织化学分析的结果显示（见图1），SelP 和ApoER-2主要在胎盘滋养层细胞处表达，图1由左到右分别为5 倍、10 倍、40 倍物镜下的图像，a 处为胎盘滋养层细胞。
图1 对照组ApoER-2和SelP在胎盘子叶的蛋白表达
2.2 SelP和ApoER-2的蛋白表达量
根据免疫组织化学分析的结果显示（见图2），妊娠母羊基础日粮添加亚硒酸钠后在40倍物镜下Apo-ER-2和SelP在胎盘滋养层细胞的表达。其中，A和C为对照组结果，B和D为试验组结果。
图2 妊娠母羊基础日粮添加亚硒酸钠后ApoER-2和SelP在胎盘滋养层细胞的表达
结果显示妊娠母羊基础日粮营养水平上添加亚硒酸钠后，母羊胎盘滋养层细胞中SelP基因的表达极显著提高（P＜0.01），胎盘滋养层细胞中ApoER-2基因的表达极显著降低（P＜0.01）（见图3）。
图3 硒对胎盘滋养层细胞ApoER-2和SelP表达的单位面积浓度（AOD）影响
为研究绵羊胎盘中SelP 和ApoER-2 的蛋白分布情况，作者采用免疫组化方法进行分析。目前的研究表明SelP在绝大多数的组织中表达，血浆和脑中SelP的主要来源分别是肝细胞和星形胶质细胞，在本试验中研究发现SelP 在绵羊胎盘滋养层细胞大量表达。ApoER-2在不同组织中的表达量不同，在大脑中它主要由神经元表达，而在人和小鼠的胎盘中ApoER-2主要在滋养层细胞表达[13-14]，这与本试验结果一致。另外，Ulrich 等[13]还发现ApoER-2 与流产和胎儿生长缓慢显著相关。
对于SelP 和ApoER-2 蛋白表达量结果作者有三种推测。第一种推测为SelP-ApoER2 在机体内存在动态平衡。肝源性SelP在硒的运输中发挥重要作用，通过受体低密度脂蛋白受体相关蛋白1（receptor-related protein1,Lrp1）、巨蛋白（megalin）和ApoER-2 介导SelP的识别和特异性摄取，构成了硒摄取和输送的系统以避免SelP通过肾脏流失[16]。目前的研究表明，动物体内的受体的数量是有限的，当配体的浓度达到一定范围时，会结合所有受体并形成动态平衡。本试验结果显示在基础日粮中添加亚硒酸钠后ApoER-2蛋白的表达量降低，这可能与SelP-ApoER2的动态平衡有关。作者推测，当体内SelP的浓度超过动物自身的需求量时，就会反馈抑制ApoER-2 蛋白的表达以避免摄入过量硒元素造成机体损伤。再者，随着妊娠时间的延长，SelP 被代谢以保证母体和胎儿硒的供应，而ApoER-2 作为受体结束SelP 的转运任务后也可能被降解。另一方面，动物体内的任何物质都不可能处于绝对静止的状态。Krol等[17]研究发现硒的转运在胎盘中是双向的，并提出这种双向转移可能与硒在胎盘、胎儿和新生儿组织中的滞留有关，这就能解释本试验中胎盘滋养层细胞ApoER-2 蛋白的表达降低的原因。还有学者提出在肝脏中SelP的合成与尿排泄代谢产物的合成存在拮抗关系[18]，也正是这种硒转运机制的动态平衡保证了机体的稳态。
第二种推测为SelP 介导的胎盘硒供应与其他组织硒供应存在潜在竞争，即硒的优先供应机制。SelP对大脑、睾丸等组织实行优先供应机制，这种优先供应机制不仅确保了硒的分层供应，还保证了关键组织中足量硒的储留和利用。Burk 等[15]在2013 年研究发现内脏卵黄囊和胎盘也具有转运硒的优先供应机制，该机制依靠SelP实现母体和胎儿硒的转运，避免妊娠母体缺硒引起胎儿的异常发育。另外，在一项小鼠的研究中发现SelP 介导的硒供应睾丸与大脑之间的潜在竞争[19]，即SelP 供应的相同或相近层级的组织间存在竞争关系。这种不同组织间SelP 的竞争可以通过抑制其他低层级组织SelP 受体的蛋白表达来实现，呈现的结果为低层级组织的ApoER-2 蛋白表达量降低。
第三种推测为介导SelP 识别与摄取的受体间或者不同的硒蛋白之间存在竞争。在硒充足的条件下，母体缺失SelP 会降低胎儿硒浓度，而母体ApoER-2的缺失对胎儿硒浓度没有影响；
仅在硒缺乏的情况下，母体ApoER-2 的缺失会造成胎儿硒浓度的降低[15]。这表明SelP 在胎盘的摄取除了与ApoER-2 的特异结合之外，可能还存在与其他非硒蛋白（例如硒代蛋氨酸）结合的方式。Burk 等[18]和Miyauchi 等[20]在大鼠胎盘中发现一种硫酸盐转运体，该转运体被亚硒酸盐和硒酸盐抑制，这表明这种硫酸盐转运体也可能参与硒的转运。Kurokawa 等[12]也提出一致的推测。但目前的研究表明，以上这几种依赖非硒蛋白的硒转运方式，需要在母体的硒含量充足的条件下才有机会实现。此外，我们目前仍不能排除GPx3 参与胎盘SelP转运的可能。
目前在人体中就已发现25种硒蛋白[21]，通过膳食摄入的硒在体内主要与含有硒代半胱氨酸的硒蛋白结合。硒蛋白的合成与硒元素的供应显著相关，但并非所有硒蛋白都以相同的方式受到影响[22-23]。机体的代谢途径和机制错综复杂，不同的硒蛋白之间的代谢途径或靶位点难免会有交叉重叠，彼此之间就会存在协同或拮抗的关系以维持机体硒的稳态。在Bermano等[24]和Bellinger等[25]的研究中就发现不同的硒蛋白也存在竞争关系，但不同硒蛋白间的协同与拮抗可能与各自的受体有关，其具体的作用机制仍需进一步探究。
总之，胎盘硒的代谢仍有许多细节有待阐明：硒是如何通过SelP-ApoER2 由母体转运给胎儿并被合理利用的？硒的优先供应机制如何在体内运行？各供应的组织之间又是如何分级的？胎盘的SelP-Apo-ER2 是否收到神经元的调节？这些待阐明问题的解决才能更好地解释本研究中SelP 和ApoER-2 蛋白表达量变化的原因及胎盘硒的代谢机制。因为硒对动物的繁殖性能很重要，进一步研究硒在胎盘的转运机制可能会解释繁殖疾病或生产性能低下等现象。
利用免疫组织化学定位发现SelP 和ApoER-2 的蛋白主要在胎盘滋养层细胞表达，在血管内皮细胞中不表达。基础日粮中添加亚硒酸钠使SelP 在胎盘的表达量极显著增加，而ApoER-2 的表达量极显著降低。本研究为揭示胎盘SelP-ApoER2 的转运机制提供了进一步的理论依据。
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