王亚萍，宋路萍，邢体坤，李静波，张静静（通信作者）
河南晟明生物技术研究院有限公司 （河南新乡 453500）
电转染主要通过物理电流击穿细胞膜形成瞬时孔隙，目的基因通过孔隙进入细胞[1]，这种方法具有操作简便、毒性小、电转染效率较高等优点，其转染效率通常在30%～90%之间[2-4]。电转染在克隆操作以及表达中具有重要作用，因此，提升基因电转染效率是当前基因工作研究人员关注的重点问题[5]。电转染效率受很多因素的影响，包括电转染缓冲液[6-8]、电转染程序[9-11]、细胞数量[12]、电转染质粒量[13-15]、电转染前后温度[16]等。不同的细胞系有不同的最佳电转染条件[17]。哺乳动物细胞的电转染通常在磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）、PBS+蔗糖或培养基中进行[18-19]。本研究分析电转染缓冲液、电转染温度和电转染质粒量3 个因素对细胞活率及电转染效率的影响，从而确定HD-BioP3 细胞的最佳电转染条件。
1.1 材料
HD-BioP3 细胞购自Horizon 公司；
GFP 质粒购自Lonza 公司；
EX-CELL®CD CHO Fusion 培养基、L-Glutamine solution、蔗糖购自默克公司；
CD Forti CHOTM培养基、PBS 购自赛默飞世尔科技公司；
0.2%台盼蓝溶液购自Countstar 公司。
1.2 仪器
电穿孔系统（品牌：Bio-Rad 伯乐，型号：Gene Pulser Xcell，用于转染每种细胞类型的模块化电穿孔系统）；
叠加式恒温振荡器（品牌：精骐，型号：IS-RDS6C，带CO2）；
二氧化碳培养箱（品牌：Heal Force，型号：HF90）；
洁净工作台（品牌：苏净安泰，型号：SW-CJ-2FD）；
电热恒温水浴锅（品牌：上海一恒，型号：HWS-28）；
全自动荧光细胞分析仪（品牌：Countstar，型号：Rigel S2）；
离心机（品牌：Eppendorf，型号：5804R）。
2.1 HD-BioP3细胞电转染优化前准备
37 ℃水浴复苏一支HD-BioP3 细胞，待细胞生长至1.5×106～4.0×106cells/ml 时，按0.2×106cells/ml 接种至生长培养基（含4 mmol/L L-Glutamine solution的CD Forti CHOTM培养基）中；
电转染前一天将细胞以0.5×106cells/ml 接种至生长培养基中培养（培养条件：转速为120 rpm，二氧化碳浓度为5%，温度为37 ℃，振幅为26 mm），24 h 后用于电转染优化。
2.2 HD-BioP3细胞电转染优化
2.2.1 HD-BioP3细胞电转染缓冲液和电转染温度优化
准备PBS、PBS+5%蔗糖、EX-CELL®CD CHO Fusion 培养基、CD Forti CHOTM培养基4 种介质作为电转染缓冲液并分别标记为Buffer1～Buffer4 备用；
取2.1 中准备的细胞，将0.2%台盼蓝溶液与细胞悬液按照1‥1 比例混合，采用全自动荧光细胞分析仪对细胞进行计数；
根据计数结果取5×106个细胞，以220 rcf 速度离心5 min，弃上清液；
取电转染缓冲液 600 μl 重悬细胞，再加入20 μg GFP 质粒，轻轻吹打混匀细胞和质粒转入电击杯，按上述步骤，Buffer1～Buffer4 各做两组，一组于常温条件下进行电击，另一组于4 ℃条件下放置5 min 后进行电击。电击参数设置如下，电压为300 V，电容为950 μF，脉冲为指数衰减，将电击后的细胞迅速转至含预热后的5 ml 生长培养基的T25 方瓶中，温度为37 ℃，二氧化碳浓度为5%，湿化过夜培养。
2.2.2 HD-BioP3细胞电转染质粒量优化
根据2.2.1 选择合适的电转染缓冲液和电转染温度，在10～100 μg 之间设置10 个梯度的电转染质粒量进行最佳电转染质粒量的优化，电击参数设置如下，电压为300 V，电容为950 μF，脉冲为指数衰减，将电击后的细胞迅速转到含预热后的5 ml 生长培养基的T25 方瓶中，温度为37 ℃，二氧化碳浓度为5%，湿化过夜培养。
2.3 分析方法
HD-BioP3 细胞电转染优化24 h 后，用0.2%台盼蓝溶液与细胞悬液按照1‥1 比例混合，采用全自动荧光细胞分析仪对细胞进行电转染效率检测及计数。
3.1 HD-BioP3细胞电转染缓冲液和电转染温度优化结果分析
电转染效率检测结果显示，在常温条件下Buffer1～Buffer4的细胞电转染效率依次为8.4%、18.8%、48.8%、22.4%，在4 ℃条件下Buffer1～Buffer4 的细胞电转染效率依次为20.9%、25.2%、67.3%、15.7%；
Buffer1 在常温和4 ℃条件下的细胞电转染效率相差12.5%，依次类推，Buffer1～Buffer4 在常温和4 ℃条件下的细胞电转染效率相差在6.4%～18.5%之间；
在同一温度下，4 种电转缓冲液的电转染效率差距较大，在常温条件下，Buffer2 和Buffer4 的细胞电转染效率相差3.6%，而Buffer3 和Buffer1 的细胞电转染效率相差40.4%，因此在常温条件下细胞电转染效率相差3.6%～40.4%，依此类推，在4 ℃条件下细胞电转染效率相差4.3%～51.6%（图1～4）。
图1 在常温条件下HD-BioP3细胞电转染24 h 后电转染效率
图2 在4 ℃条件下HD-BioP3细胞电转染24 h 后电转染效率
HD-BioP3 细胞电转染优化24 h 后，结果显示，在常温条件下，Buffer1 和Buffer3 细胞活率均＆gt;80%，Buffer4 细胞活率＆lt;60%（图3）；
在4 ℃条件下Buffer3 细胞活率＆gt;80%，Buffer1 和Buffer4 细胞活率＆lt;60%（图4）。
图3 常温条件下HD-BioP3细胞在电转缓冲液Buffer1～Buffer4中细胞活率和电转染效率
图4 在4 ℃条件下HD-BioP3细胞在电转缓冲液Buffer1～Buffer4中细胞活率和电转染效率
3.2 HD-BioP3细胞电转染质粒量测试
根据3.1 选择细胞转染效率和细胞活率均最高的实验条件，即选择Buffer3 作为电转染缓冲液在4 ℃条件下进行电转染质粒量优化，结果显示，随着电转染质粒量的增加，细胞活率呈逐渐下降，10～30 μg 电转染质粒量细胞活率＆gt;70%，40～70 μg 电转染质粒量细胞活率在60%～65%之间，80～100 μg 电转染质粒量细胞活率均＆lt;50%。随着电转染质粒量的增加，电转染效率逐渐升高；
电转染质粒量为30 μg 时电转染效率达到平台期，电转染质粒量＆gt;70 μg 时电转染效率出现下降趋势，电转染质粒量不同造成电转染效率最大相差24.6%（图5～7）。
图5 HD-BioP3细胞电转染24 h 后电转染效率
图6 HD-BioP3细胞电转染24 h 后电转染效率
图7 HD-BioP3细胞不同电转染质粒量细胞活率和电转染效率
电转染是一种常用的细胞转染方法[20]，目的基因能否进行表达，取决于表达目的基因能否成功进入细胞[21]；
这种电转染方式虽然操作简单，电转染效率高，但不合适的电转染条件容易导致细胞无法形成电穿孔或死亡，造成电转染效率下降[22]。
本研究结果显示，在测试3 个因素对电转效率的影响实验中，不同电转染缓冲液对电转染效率影响最大相差51.6%，其次为不同电转染质粒量，电转质粒量对电转染效率影响最大相差24.6%，电转染温度影响较小，不同电转染温度对电转染效率影响最大相差18.5%。故在EX-CELL®CD CHO Fusion 作为电转染缓冲液、电转染温度为4 ℃、电转染质粒量为30 μg 的条件下，电转染效果最好。
综上所述，优化HD-BioP3 细胞的电转染条件，可为研究外源基因电转染HD-BioP3 细胞提供基础数据。
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