钱石兵，张凌鹏，殷凌云，李昌全，李 虎，于鸿滨
（昆明市延安医院，昆明医科大学附属延安医院 口腔科，云南 昆明 650051）
临床中因为牙体牙髓、牙周等疾病导致的牙槽骨缺损已经屡见不鲜，这为后续的修复造成了严重的不便，进而影响患者的生理和心理健康[1]。尽管自体骨的移植疗效可能是更好的，但其对供区造成一定的创伤，一些骨替代材料开始运用于临床。其中Bio-Oss 无机小牛骨颗粒被普遍用于临床，得到国际的广泛认可[2]。Bio-Oss 骨粉具有超级多孔结构，有助于间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）爬行附着于骨粉表面分化形成新骨。牙髓干细胞（dental pulp stem cell，DPSC）是一类具有高度的分化能力的牙源性干细胞，如神经细胞、脂肪细胞、成骨和软骨细胞、血管细胞和牙本质细胞等[3，4]。多项研究证明Bio-Oss 骨粉与DPSC 具有良好的相容性、可行性和安全性，能够有效促进骨修复和愈合，显示出良好的应用前景[5−7]。但是鲜有文献提及Bio-Oss 骨粉与DPSC 的合适配比，若配比不合适，则会影响成骨的速度和效率。因此，本课题拟初步探究Bio-Oss 骨粉与DPSC 的大致配比，以期为临床应用提供有价值的信息。
1.1 主要仪器和试剂
0.25%胰蛋白酶（BI，以色列）；
磷酸盐缓冲液（PBS，索莱宝）；
α-MEM 培养基（Gibco，美国）；
胎牛血清（BI，德国）；
Human MSC Analysis Kit（BD，美国）；
Human MesenCult™ Osteogenic Differentiation Kit（Stemcell，加拿大）；
Human MesenCult™ Adipogenic Differentiation Kit（Stemcell，加拿大）；
茜素红（索莱宝）；
油红O（索莱宝）；
酶联免疫检测仪（Thermo，美国）；
流氏细胞仪（BD，美国）；
碱性磷酸酶活性检测试剂盒（碧云天）；
GFP 慢病毒（吉凯，中国）。
1.2 方法
1.2.1 DPSC 的分离、培养及鉴定经昆明医科大学附属延安医院伦理委员会审批通过，患者监护人签字同意，在口腔外科收集新鲜拔除、无牙体牙髓及牙周疾病且根尖未发育完全的第三磨牙。迅速用含2%双抗的α-MEM 培养基保存放入冰盒中，随即在细胞工作间中处理标本。用含2%双抗PBS 冲洗彻底清除血凝块并刮除根面软组织，使用咬骨钳将牙齿劈开，获取无损伤的牙髓组织，使用1 mL 注射器反复捣碎牙髓组织，转移至培养皿中倒置放入37 ℃细胞培养箱中温育15 min，加入含20% FBS 的培养基，动作轻柔勿使组织块浮起，每3 d 换液，待细胞大量爬出后消化细胞传代扩大培养。
流式细胞术鉴定：取第4 代DPSC 消化、离心，PBS 重悬，制备成单细胞悬液计数备用。以每管5×105个细胞数加入流式管内，根据试剂操作说明，加入CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR、CD73、CD90、CD105 抗体，避光孵育30 min。加入鞘液清洗1 遍，弃上清，然后加入200～300 µL 的鞘液上机，检测细胞表面抗原，进行免疫表型分析。
1.2.2 DPSC 成骨、成脂向分化取第4 代DPSC，每孔5×105个细胞接种于6 孔板内，待细胞融合在 80%以上时更换 Human MesenCult™Osteogenic Differentiation Kit 和Human MesenCult™ Adipogenic Differentiation Kit，对照组正常培养，连续培养3 周后吸弃培养基并用PBS漂洗，加入70%乙醇固定细胞2 h，PBS 洗3 遍，加入茜素红和油红O 染色5 min，倒置显微镜下观察染色的面积大小以及颜色深浅。
1.2.3 GFP 病毒转染DPSC根据吉凯病毒转染手册，预实验摸得GFP 病毒转染DPSC 的MOI=10。取24 孔板，每孔接种4×104个细胞，细胞融合至90%左右加入嘌呤霉素，设置0.25 µg/L、0.5 µg/L、1 µg/L、1.5 µg/L、2 µg/L 浓度，摸得48 h杀死全部细胞的最低浓度为0.5 µg/L。取第3 代DPSC 和6 孔板，每孔接种5×105个细胞，计算并加入相应的慢病毒体积，转染96 h 后换液，加入0.5 µg/L 嘌呤霉素培养基，杀死野生型细胞。
1.2.4 碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）活性检测取24 孔板，每孔加0.05 g 骨粉铺满孔板底，成骨培养基浸润骨粉后，分别加入1×105、2×105、4×105、8×105个细胞，对照组不加骨粉，其余条件一致培养。分别在培养第3 天和第7 天时用1%×-Trition 裂解细胞，4 ℃下，14000 g离心3 min 后取上清，按照碧云天碱性磷酸酶试剂盒操作说明测定ALP 活性。
1.2.5 SEM 扫描DPSC 在骨粉表面黏附的情况按照同上条件，Bio-Oss 和DPSC 复合培养7 d 后，小心吸弃培养液，每孔加入1 mL 赛维尔扫描电镜固定液，4 ℃ 固定细胞4 h 后送至赛维尔生物公司进行扫描电镜。
1.3 统计学处理
2.1 DPSC 的培养及多向分化能力鉴定
牙髓组织采用组织块法贴壁培养5 d 后镜下可见类成纤维样的细胞沿着组织块边缘呈放射状爬出（图1A），传代后细胞生长速度加快（图1B）。对照组则无红色的颗粒（图1C）。细胞连续诱导成骨3 周后茜素红染色后可见大量明显红色的颗粒（图1D），对照组则未见染红的脂滴（图1E），细胞向成脂诱导3 周后油红O 染色后可见有脂滴被染红（图1F）。表明DPSC 具有多向分化潜能，属于间充质干细胞来源。
2.2 DPSC 表面标记物的检测
流式细胞术检测显示间充质干细胞表面标志物CD73 占99.90%，CD90 占99.96%、CD105 占99.08%，均呈阳性高表达，而造血细胞标记物CD34、CD45 以及免疫细胞表面标记物CD19、CD11b、HLA-DR 则呈阴性（占0.12%），证明属于间充质干细胞家族，排除造血来源的干细胞（图2）。
图2 流式鉴定DPSC 干细胞标记物Fig.2 Identification of DPSC surface antigen by flow cytometry
2.3 GFP 病毒转染DPSC 以及DPSC 在骨粉中的生长形态
在转染GFP 后，48 h 后荧光显微镜下可见散在少量的荧光表达，在96 h 达到高峰（图3A～3C）。GFP-DPSC 在Bio-Oss 骨粉中可以很好的生长和增殖，随着培养时间的延长，细胞逐渐爬行至骨粉的深部孔隙之中（图4A～4B）。
图3 GFP 转染DPSC 不同时间荧光表达（×100）Fig.3 Fluorescence expression of GFP transfected DPSC at different time
图4 GFP-DPSC 在Bio-Oss 骨粉中的生长（×100）Fig.4 Growth of GFP-DPSC in Bio-Oss bone powder
2.4 不同浓度DPSC 成骨分化ALP 活性比较
第3 天和第7 天与对照组相比，DPSC 复合骨粉培养后ALP 活性比对照组高，P<0.05，差异具有统计学意义，说明不同数目的DPSC 复合同样质量的Bio-Oss 骨粉的成骨能力是不一致的。第3 天时，各组ALP 活性呈指数型曲线，但到第7 天时，4×105和8×105组的ALP 活性并没有与第3 天时的保持一致，细胞数目翻倍，但8×105组的ALP 活性并没有翻倍，出现了下降的趋势（图5 和图6）。
图5 第3 天ALP 活性比较Fig.5 Comparison of ALP activity on day 3
图6 第14 天ALP 活性比较Fig.6 Comparison of ALP activity on day 14
2.5 SEM 扫描结果
SEM 扫描图片发现1×105（图7）和2×105（图8）组黏附爬行在骨粉表面的细胞数目较少，4×105（图9）组细胞数目稍多，8×105（图10）组爬满整个骨粉表面，部分细胞呈复层生长。细胞在骨粉表面爬行黏附后会伸出伪足与骨粉表面进行连接（图7～10）。
图7 1×105 组同一视野下SEM 图像Fig.7 SEM images of 1×105 groups in the same field of view
图8 2×105 组同一视野下SEM 图像Fig.8 SEM images of 2×105 groups in the same field of view
图9 4×105 组同一视野下SEM 图像Fig.9 SEM images of 4×105 groups in the same field of view
图10 8×105 组同一视野下SEM 图像Fig.10 SEM images of 8×105 groups in the same field of view
众所周知，支架和干细胞是再生工程的两个关键要素，Bio-Oss 骨粉已经被广泛用于口腔牙槽骨缺损的患者，其临床疗效已经得到认可，能够有效形成新骨，修复骨缺损[7−9]。Bio-Oss 骨粉作为一种替代的生物材料，具有高柔韧性和可塑性以及最少的感染和免疫反应风险[10，11]。Bio-Oss 骨粉可以为多种MSC 的存活提供良好的环境，MSC 能够附着在Bio-Oss 支架上增殖和分化[12]。在动物研究中，植入Bio-Oss 骨粉的MSC 增加了支架与宿主骨的整合，并将其形态改变为成骨样细胞[13]。在体外循环压缩压力下，在循环压缩压力下，骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cell，BMSC）向成骨细胞的分化显著增加[14]。在上颌窦底提升过程中，植入BMSC 和Bio-Oss 的加压复合物可促进新骨的形成[15]。在脂肪来源的干细胞（adipose-derived stem cell，ADSC）和Bio-Oss 的复合物局部注射信号素3A（Sema3A）促进了2 型糖尿病的大鼠颅骨骨再生[16]
尽管Bio-Oss 骨粉与MSC 能够更好的促进成骨，但是很多实验并未明确指出MSC 的接种数目和合适的Bio-Oss 质量。而且，笔者认为固定质量的Bio-Oss 骨粉所能容纳的干细胞数目是有限的，如果干细胞数目过少，则无法充满骨粉的孔隙，成骨的效率减弱；
若干细胞数目过多，则会造成竞争，造成干细胞资源的浪费。另一方面，干细胞的种类也同样影响接种数目，因为不同的干细胞其大小、增殖能力和分化能力是不一致的[17，18]。ADSC、BMSC 和DPSC 都具有形成矿化组织的能力。然而，对于其矿化组织工程能力的比较研究较少，未得到充分的探索。研究发现，DPSC 的成骨潜能明显大于BMSC 和ADSC，DPSC 具有产生相对高量矿化基质的最大潜力[19]。将BMSC 和DPSC 联合Bio-Oss 移植在颅面区域促进骨再生，发现2 组具有相似的骨密度、新骨形成和成骨相关蛋白表达，在体内的骨再生效果相匹配[20]。一项meta 分析评价显示，与对照组相比，在4 周时，DPSC 与支架复合物的新骨形成显著增加[21]。但是在阅读文献时发现没有明确的细胞和骨粉用量，作者是否认为这不是一个重要的信息所以没有描述。如Wang 等[22]仅描述以2 × 106细胞/mL 的密度将BMSCs 悬液加入Bio-Oss 颗粒中，未说明骨粉具体质量，但是DPSC与BMSC 的细胞形态大小以及分化能力是不一致的，所以BMSC 接种的数目对DPSC 而言并没有太多的指导价值。
Bio-Oss 骨粉作为固体颗粒具有遮光性，普通光镜下无法看到细胞的状态，因此本课题预先将GFP 慢病毒成功转染DPSC 并筛选扩大培养以便于在荧光显微镜下观察。笔者发现大约0.05g的骨粉可以均匀散在的铺在24 孔板的底部，将细胞数目定为1×105、2×105、4×105、8×105四组。ALP 是成骨分化过程中细胞分泌的的一种酶，它的表达活性是成骨细胞分化、成熟一个非常明显的特征[23]。在第3 天时，ALP 活性测定的数值发现8×105组几乎是4×105的两倍，与细胞数目增长的趋势大致相同。但是在第7 天时，4×105但8×105组却没有出现预期的结果，与第3 天的结果保持一致，反而稍稍出现了一个降低的趋势，说明随着培养时间的延长，细胞数目增殖过多，抑制了成骨分化的效率。隔天在荧光显微镜下监测GFP-DPSC 在Bio-Oss 骨粉中的生长状态，发现着培养时间的延长，细胞形态发生了变化，部分逐渐变成了不规则的形状，不再是长梭形的类成纤维细胞样形态。Bio-Oss 骨粉之间的孔隙并非完全规则的，并且骨粉作为一种刚性物质，干细胞需要做出改变以适应这样的结构，而且Bio-Oss 骨粉没有细胞毒性，并不会影响干细胞的增殖[24]。通过扫描电镜发现，1×105、2×105两组细胞较为散在的附着在骨粉表面，4×105组细胞比较密集的附着在骨粉表面，而8×105组则看见细胞堆叠生长。通过放大电镜下观察倍数发现，细胞表面可伸出部分伪足附着于骨粉之上，形成更为紧密的连接。
干细胞成骨分化是一个周期较长的过程，细胞逐渐爬行到骨粉更深的内部结构之中，骨粉作为一个立体的物质，荧光显微镜下可以在不同层面观察到细胞，但是这也为笔者无法全面观察细胞带了一定的影响。在实验过程中笔者发现GFPDPSC 和Bio-Oss 骨粉复合物培养时间到成骨中后期，GFP 的荧光强度逐渐减弱，这是由于干细胞分化过程中已经不再是干细胞，而是逐渐变为成骨细胞[25]。另一方面，细胞在诱导分化过程中仍在增殖，因此笔者尝试连续在成骨培养基中诱导21 d 后用DAPI 染色，在蓝色荧光下根据细胞核显色的数目大致估计培养21 d 后的细胞数目。由于Bio-Oss 骨粉均能被蓝色荧光和绿色荧光激发成像，而且在不同层面均能观察到细胞，这对实验结果造成了干扰。尽管结果不理想，但仍旧可以作为一个参考，4×105、8×105两组的细胞可以在镜下看到密集的蓝色的细胞核。
通过以上实验结果，笔者认为0.05 g Bio-Oss 骨粉接种4×105～8×105个细胞是一个合适的密度范围，细胞在骨粉中爬行生长需要一定的时间，而且干细胞具有强大的增殖能力，若开始时细胞接种数目过多，则会对细胞的生长和增殖造成抑制，反而影响成骨效率。根据现有的实验结果，未来还需进行免疫组化和Micro-CT 精细扫描获得更精确的结果完善实验完整性。
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