夏新宇 李 磊 王少康 许硕贵 王美堂
热射病(heat stroke, HS)是重症中暑中最为严重的一种分型，以核心体温>40.0±0.5℃，中枢系统病变 (如谵妄、惊厥、昏迷等)，系统性炎症及多脏器损害为特征[1]。即使该类患者给予积极治疗后，仍有75%病患发展至多脏器衰竭[2]。肝损伤在HS中常见，通常损伤较轻，但是在治疗过程中有可能发展成为急性肝衰竭，导致患者的死亡[3, 4]。
乳铁蛋白(lactoferrin, LF)是一种80kDa的低分子铁结合糖蛋白，广泛存在于哺乳动物组织和体液内，具有调节免疫、抗炎、抗氧化等作用[5]。不同物种之间的LF具有高度同源性[6, 7]。本研究聚焦口服牛乳铁蛋白(bovine lactoferrin, BLF)对HS大鼠肝损伤的改善情况，以期找到一种减轻HS危害的防治方法。
1.动物和材料：64只成年雄性Sprague-Daw大鼠(7～8周龄，体质量为250～300g)购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司[生产许可证号：SCXK(沪)2008-0016]。购得大鼠饲养于中国人民解放军海军军医大学无特定病原体级动物实验中心，每笼6只，室内温度为22±1℃，相对湿度为50%±5%，保持12h白天/12h黑夜昼夜节律。BLF购自湖北威德利化学科技有限公司(CAS编号：112163-33-4，500克/袋，纯度：98%)。本研究通过中国人民解放军海军军医大学动物伦理学委员会审批(伦理审批号：SMMU—2017324)。
2.分组和干预：64只大鼠按照完全随机化分组方式分成 4组，即对照组(n=16)、热射病组(HS组，n=16)、低剂量干预组(LBLF组，n=16)和高剂量干预组(HBLF组，n=16)。对照组及HS组大鼠以磷酸盐缓冲液10ml/kg灌胃1周，LBLF及HBLF组分别以100、200mg/kg BLF灌胃1周。
3.HS造模：本研究采用恒温恒湿箱将造模环境温度稳定在40.0±0.5℃，相对湿度稳定在60%±5%。在腹腔植入测温胶囊监测大鼠核心体温的变化，造模和监测方法同前[8]。以大鼠核心体温到达42℃为HS发病的标准[9]。对照组置于25.0±0.5℃，湿度50%±5%环境中1h，禁食禁水。
4.样本收集：造模开始至造模后3h内，若存活大鼠少于每组最低要求(n=8)，补充实验达到数量要求。最终每组各8只，共32只大鼠用于样本的收集。造模后3h，以异氟烷气道麻醉大鼠，经腹主动脉采集血液样本，4℃下，以3000r/min离心10min，收集上清液于-80℃冰箱冻存待测。获取血清样本后，打开大鼠腹腔，充分暴露肝脏获取部分肝脏组织，立即浸泡于4%多聚甲醛溶液，以既往使用方法处理后分析病理情况[8]。再次获取肝脏组织，吸水纸吸干表面液体，冻存于-80℃冰箱冻存，根据需要取对应重量制备肝脏组织匀浆测定丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量，超氧化物岐化酶(superoxydismutase, SOD)活性。
5.指标测定：(1)血清生化数据的测定：用全自动生化分析仪(日立7080，日本日立公司)测定血清丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase, ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase, AST)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)水平。(2)脂质过氧化反应水平和SOD的测定：用MDA试剂盒(货号：A003-1，南京建成生物工程研究所)测定肝脏匀浆中MDA浓度反应脂质过氧化水平。用SOD试剂盒(货号：A001-3，南京建成生物工程研究所)测定肝脏组织匀浆中SOD活力。方法参照Deng等[10]的研究。(3)肝脏病理评分：随机选取每张肝脏切片的8个区域在200倍光镜下参照Zhou等[11]的研究进行病理评分。
1.核心体温变化：与HS组(57.75±4.71min)比较，LBLF组(71.00±5.29min)、HBLF组(90.88±3.56min)核心体温到达HS发病标准(42℃)的平均时间均显著延长(P<0.001)。
2.血清生化指标的变化：在HS发生3h后，HS组血清ALT、AST、LDH均较对照组显著升高。与HS组比较，LBLF组稍有改善，但差异无统计学意义(P>0.05)，而HBLF组显著改善了这3项指标水平(P<0.05，表1)。
表1 4组大鼠血清生化指标水平变化
3.肝脏组织匀浆脂质过氧化水平和SOD活性变化：HS组MDA含量较对照组显著升高，但是SOD活力比较差异无统计学意义。LBLF组对于SOD活性以及MDA含量影响比较，差异无统计学意义，HBLF组和HS组比较，SOD活性显著提高，同时MDA含量也显著下降(表2)。
表2 4组大鼠SOD活性和MDA含量变化
4.肝脏病理评分改变：HS组肝脏病理切片可见肝细胞大量坏死，细胞核深染，嗜酸性粒细胞增多，细胞质呈圆形空泡，局部胆管周围粒细胞浸润。LBLF组中，肝脏病理破坏好转，HBLF组进一步改善(图1)。LBLF组、HBLF组均较HS组病理评分显著下降(5.95±0.44、3.00±0.49、8.22±0.31分，P<0.001)。
图1 4组大鼠肝脏病理切片变化(HE染色，×200)A.对照组肝脏病理切片：肝细胞索间界清晰，细胞质界线明显，细胞质内偶有小空泡；
B.热射病组肝脏病理切片：肝细胞肿胀明显，索间界模糊，肝细胞细胞核染色加深，细胞质内空泡显著增多，细胞周围炎性细胞浸润及充血；
C.LBLF组肝脏病理切片：肝细胞索间界较清晰，细胞质内空泡减少，细胞周围炎症及充血减轻；
D.HBLF组肝脏病理切片，肝细胞索间界清晰，肝细胞无肿胀，炎性细胞减少，充血显著减轻。黑色箭头所示为肝细胞肿胀坏死；
绿色箭头所示为细胞质空泡；
蓝色箭头所示为炎性细胞浸润；
红色箭头所示为充血
据统计，HS的发生率有逐年升高的趋势，即使救治得当，仍有较高的病死率[12]。因此，寻求有效措施预防HS的发生显得尤为重要。肝脏作为机体的重要解毒器官，在HS的病程中常受到损害[13]。早期保护肝功能，可以更有效地维持机体免疫调节能力。严重的肝损害是HS脏器损害的一个重要特征，高热、低血压、脏器血流再分配都是引起肝损害的原因[14]。高热具有细胞毒性，往往在早期引起肝脏的损伤[3]。LF具有抑制促炎性细胞因子、促进抗炎性细胞因子产生的作用[15]。目前尚无研究探索预口服LF对于HS肝损害的保护作用。本研究通过给予SD大鼠预口服高低剂量的BLF后建立HS模型，通过分析大鼠造模时达到目标体温时间、血清生化水平、肝脏组织匀浆SOD活力、MDA含量及病理评分等相关因素的变化，评估BLF对于HS大鼠肝脏的保护作用。在给予BLF预口服后，大鼠核心温度达到HS标准的时间明显延长，而且随着口服BLF浓度的增高进一步延长。可以得出结论，高、低剂量BLF均可以有效提高大鼠的热耐力。
肝细胞破坏时，ALT、AST、LDH大量释放入血，其升高程度和肝细胞破坏呈正相关，过度的肝细胞破坏会导致肝功能进一步受损。LBLF组、HBLF组的生化指标显著下降提示BLF可以使得HS大鼠肝细胞破坏减少，尽可能在HS早期保留肝脏功能。LF可以通过核转录因子-κB (nuclear factor-kappa B，NF-κB)和MAP激酶这两条信号通路，在细胞水平上调节细胞免疫[15]。HS发生后，肠源性内毒素血症导致内毒素进入体循环加重机体的炎症损伤[16, 17]。Geng等[4]研究发现，HS激活了肝脏中的炎性小体，活化的炎性小体诱导肝细胞凋亡，加重肝脏损伤。综上所述，LF可能通过其抗炎作用，缓解肝脏损伤。
MDA是脂质过氧化反应的终末产物，通过测定其水平高低可以反映脂质过氧化反应严重程度[18]。Zhang等[19]研究发现，红景天苷可以抑制HS大鼠肝脏内脂质过氧化反应改善肝损害。本研究结果显示，HS组大鼠肝脏组织匀浆中MDA浓度的显著提高。LF可以通过清除一氧化氮和1，1 -二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基而发挥抗氧化活性[20]。口服LF可以显著提高SOD的活性[21]。
综上所述，给予BLF预口服的大鼠在HS发生后肝脏组织匀浆SOD显著升高，MDA含量下降，提示脂质过氧化反应的减轻。预口服BLF可以有效改善HS大鼠肝脏的脂质过氧化反应水平，改善病理损伤，提高大鼠热耐力，提示口服BLF可能是防治HS的一种有效措施。本课题组拟设计更多实验进一步探讨BLF在HS肝脏损伤中的保护机制。
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