周 佳，许倩倩，杨跃飞，王彦红,3
(1. 扬州大学兽医学院，江苏 扬州 225009 ；
2. 扬州大学 江苏高校动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，江苏 扬州 225009 ；
3. 江苏省人兽共患病学重点实验室，江苏 扬州 225009)
大肠埃希菌(Escherichiacoli，E.coli)俗称大肠杆菌，是一种常见的致病菌。由于抗菌药的频繁使用，导致动物养殖环境中致病性大肠杆菌耐药菌株大量产生。这些耐药菌通过多种途径进行传播,或将其耐药基因通过畜禽产品直接传递给人类致病菌，引起交叉耐药,对人类健康构成了严重的威胁[1]。
氨基糖苷类抗菌药属于广谱抗菌药，具有高效、药物动力学优良和与其他抗菌药物有协同作用等特点，是治疗大肠杆菌感染的常用药物。氨基糖苷类抗菌药可作用于原核细胞核糖体30S亚单位中16S rRNA的A位，使细菌在合成蛋白的过程中发生错误翻译，错误的蛋白质插入细胞膜造成其断裂从而使细胞内重要物质外漏，细胞迅速死亡[2]。但因为氨基糖苷类药物在临床治疗中的过度使用和不合理使用，对其耐药的临床分离株越来越多。细菌对氨基糖苷类药物的耐药机制主要有3种：改变细胞膜通透性、激活外排泵系统,使抗菌药物在细菌胞体内积聚量减少；
产生氨基糖苷类药物修饰酶，灭活药物；
核糖体结合位点的改变，包括A位点的突变和16S rRNA甲基化酶对靶位点的修饰作用[3]。本试验选取大肠杆菌aac(3)-II、arm(A)和aac(6′)-Ib三种耐药基因进行检测分析，以期为大肠杆菌耐药性的研究提供参考。
1.1 病料来源 采集2018年1—3月扬州大学动物医院畜禽门诊和宠物门诊的送检病例，共收集115例病例的病料，送检病例包括鸡29例，鹅32例，犬25例，猫15例，猪10例，兔1例，鸽3例。畜禽门诊病例取病死动物(如鸡、鹅和猪)的肝和脾等组织作为病料，宠物门诊病例取送检样品(如子宫蓄脓或有尿道炎症的样品)的犬猫尿样作为病料。
1.2 主要试剂与仪器 生化鉴定管、麦康凯琼脂培养基、营养琼脂培养基和药敏试纸片，均购自杭州微生物试剂有限公司；
PCR试剂盒，购自宝生物工程(大连)有限公司；
TaKaRa LATaq酶、dNTP Mixture、10×LA PCR BufferⅡ (Mg2+plus)、100 bp DNA Ladder、Super GelRed 10 000×in Water、10× Ladder Buffer,均购自生工生物工程(上海)股份有限公司。超净工作台(型号为SW-CJ-IL),购自苏州净化工作台设备有限公司；
恒温培养箱(型号为GNP9080),购自上海精宏试验设备有限公司；
DNA扩增仪(型号为4484073)，购自北京智杰方远科技有限公司；
凝胶电泳仪(型号为DYCP-31DN)，购自北京六一生物科技有限公司。
1.3 细菌分离和鉴定 将采集来的病料划线于麦康凯平板，37 ℃培养18 h；
挑取典型菌落在麦康凯平板上分区划线，37 ℃培养18 h，再挑取单个菌落经革兰染色，显微镜观察其形态。将纯化后的细菌接种到各生化发酵管中培养并进行靛基质试验、甲基红试验、V-P试验和枸橼酸盐利用试验(即IMViC试验)。
1.4 药敏试验 药敏试验判断标准采用美国临床实验室标准化协会(Clinical and Laboratory Standard Institute,CLSI)2013年推荐的抗菌药物敏感试验纸片法[4]。检测分离菌对β-内酰胺药物、氨基糖苷类药物、氟喹诺酮类药物、磺胺类药物共7大类18种药物的耐药情况。采用WHONET 5.6软件对药敏试验结果进行分析。
1.5 耐药基因检测 参照参考文献[5-7]设计aac(3)-II、arm(A)和aac(6′)-Ib基因的引物，引物由生工生物工程 (上海) 股份有限公司合成。分离菌株按照煮沸裂解法提取DNA，以DNA作为模板进行PCR扩增。PCR反应体系：10× Buffer 2 μL，dNTP 0.4 μL，上、下游引物各0.2 μL，Taq酶0.2 μL，灭菌双蒸水补充至20 μL。PCR扩增程序：95 ℃预变性4 min[aac(3)-II和aac(6′)-Ib]或5 min[arm(A)]；
94 ℃变性45 s[aac(3)-II和aac(6′)-Ib]或1 min[arm(A)],52 ℃[aac(3)-II]或53 ℃[aac(6′)-Ib和arm(A)]退火 45 s，72 ℃延伸50 s[aac(3)-II和aac(6′)-Ib]或1 min[arm(A)],共30个循环；
最后72 ℃再延伸8 min。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳观察结果。其中aac(6′)-Ib检测阳性产物送至南京金斯瑞生物科技有限公司进行测序，测序结果上传至GenBank进行比对，分析其是否发生变异。
2.1 细菌分离和鉴定 采集样品经麦康凯平板划线培养后，培养基上有圆形、表面光滑的粉红色菌落生长。革兰染色后镜检可观察到革兰阴性杆菌。分离菌株IMViC试验结果为“+、+、-、-”，与大肠杆菌生化特性一致。从115例病例的病料中共分离出65株大肠杆菌，包括鹅源19株，鸡源18株，犬源11株，猪源10株，猫源4株，鸽源2株,兔源1株。
2.2 药敏试验 65株大肠杆菌分离菌株的耐药情况见表1，分离菌株对链霉素、复方新诺明、阿莫西林、庆大霉素、环丙沙星、诺氟沙星、氟苯尼考和多西环素耐药率均高于50.00%，耐药率最高的为链霉素(75.38%)，其次为复方新诺明(69.23%)，最低为头孢哌酮舒巴坦(0%)。不同动物对药物的耐药程度略不同，氨基糖苷类阿米卡星、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、链霉素和妥布霉素的耐药率在鹅源大肠杆菌上分别是11.11%(2/18)、17.14%(6/35)、14.29%(4/28)、22.22%(6/27)、28.57%(14/49)和25.00%(7/28)；
鸡源大肠杆菌上分别为50.00%(9/18)、37.14%(13/35)、35.71%(10/28)、48.15%(13/27)、32.65%(16/49)和32.14%(9/28)；
在犬源大肠杆菌上分别是22.22%(4/18)、20.00%(7/35)、17.86%(5/28)、11.11%(3/27)、12.25%(6/49)和17.86%(5/28)；
在猪源大肠杆菌上分别是11.11%(2/18)、20.00%(7/35)、21.43%(6/28)、14.81%(4/27)、18.37%(9/49)和14.29%(4/28)；
在猫源大肠杆菌上分别是5.56%(1/18)、2.86%(1/35)、3.57%(1/28)、0、4.08%(2/49)和3.57%(1/28)；
在鸽源大肠杆菌中分别是0、2.86%(1/35)、7.14%(2/28)、3.70%(1/27)、4.08%(2/49)和7.14%(2/28)；
兔源大肠杆菌对氨基糖苷类药物敏感。
表1 65株大肠杆菌分离菌株的耐药性分析
2.3 耐药基因检测 对65株大肠杆菌分离株进行aac(3)-II、arm(A)和aac(6′)-Ib耐药基因检测，部分菌株分别扩增出了412、482和315 bp目的条带。统计结果见表2，14株分离菌株仅aac(3)-II基因呈阳性(21.54%，14/65)，其中3株为鹅源，5株为鸡源，2株为犬源，4株为猪源；
1株分离菌株仅携带aac(6′)-Ib-cr5基因(1.54%，1/65)，为猫源；
4株分离菌株同时携带aac(3)-II和aac(6′)-Ib-cr5基因(6.15%，4/65)，其中2株为鹅源，2株为猪源；
1株分离菌株同时携带aac(3)-II、aac(6′)-Ib-cr5和arm(A)基因，为鹅源；
而鸽源和兔源均没有携带检测的3种基因。
表2 65株大肠杆菌分离株耐药基因的PCR检测
2.4 多重耐药分析 65株动物源大肠杆菌分离菌株中51株对3类及以上的药物表现耐药，呈多重耐药，其中鸡源占比最多，为27.69%，其次为鹅源(21.54%)(表3)。
表3 65株大肠杆菌分离株的多重耐药比率
本试验从115例临床送检病例中共分离出65株大肠杆菌，鹅源、鸡源、鸽源分离率都超过了50%；
药敏试验结果显示，氨基糖苷类抗菌药中链霉素耐药率最高，为75.38%；
阿米卡星最低，为27.69%；
然而，鸡源大肠杆菌对其中几种氨基糖苷类抗菌药耐药率较高，分别为阿米卡星50.00%(9/18)、庆大霉素37.14%(13/35)、卡那霉素35.71%(10/28)、新霉素48.15%(13/27)，此氨基糖苷类抗菌药耐药性比展天松等[8]、朱永江等[9]的研究结果略有上升。本试验耐药基因检测结果与他人研究结果[8,9]相似，aac(3)-II是江苏地区氨基糖苷类主要流行基因，aac(3)-II能修饰庆大霉素和妥布霉素，aac(3)-II与庆大霉素的符合率为54.29%，与妥布霉素的符合率为67.86%，二者存在差异表明虽然多种氨基糖苷类药物可以被一种钝化酶修饰，然而酶对底物有严格的选择性，这会造成其反应的速度不一致，最终使得其耐药性发生了较大的差异[8]。aac(6′)-Ib在辽宁和广西等地区猪源大肠杆菌中携带率较高[10，11]。aac(6′)-Ib能修饰阿米卡星、妥布霉素和卡那霉素，氨基糖苷乙酰转移酶的变异基因aac(6′)-Ib-cr能使氨基糖苷类药物和氟喹诺酮类药物同时失活。该基因编码的灭活酶可使环丙沙星和诺氟沙星中的氨基氮发生乙酰化,从而使其抗菌活性下降[5]。较多研究表明，大肠杆菌中aac(6′)-Ib出现变异可增加对环丙沙星的耐药[5，10，12]。本试验中6株携带aac(6′)-Ib-cr基因的分离菌株对环丙沙星和诺氟沙星耐药均为100%。本试验65株大肠杆菌分离菌株中共有51株呈多重耐药，其中鸡源多重耐药的情况最普遍，可能与鸡在饲养过程中抗菌药物的用量大、种类多和频率高有关，导致鸡源的耐药水平偏高。分析大肠杆菌对氨基糖苷类药物的耐药性并检测其耐药基因，有利于预测大肠杆菌潜在的耐药问题，从而对指导临床合理用药具有十分重要的意义。