王 硕，董 浩，刘 珊，姬卫秀，赵云罡
慢性疲劳是一种常见生理状态，全球大约10%～15%的人群都存在慢性疲劳。如果不对这一症状采取措施，将会严重影响人的正常生活质量[1]。运动性疲劳是人体脑力和体力持续活动到一定阶段时出现的一种正常生理现象。在体育比赛中，疲劳是影响运动员表现的重要因素[2]。适度的运动性疲劳对运动员运动能力的提高是有益的，但过度疲劳或疲劳恢复不及时不完全，就会造成疲劳累积，危害机体健康，导致运动能力下降。
运动性疲劳通常与现代生活方式引起的应激相关，尤其是运动不足。关于运动疲劳产生机制的理论很多，如“内环境稳定性失调学说”、“耗竭学说”和“自由基学说”等[3]。运动时，体内自由基生成增多，自由基可氧化蛋白质，破坏其正常结构，使得蛋白功能和活性受损；
自由基还会氧化多不饱和游离脂肪酸，引起脂蛋白氧化，影响细胞膜流动性和通透性[4]。剧烈运动则会引起肌纤维损伤，使中性粒细胞、巨噬细胞等炎症细胞在损伤肌肉位点聚集，引发氧化损伤[5]。通过补充营养物质以降低疲劳相关生化指标变化水平、减轻疲劳程度和促进疲劳恢复、促进运动能力提高，是抗疲劳研究和应用的重要手段。研究显示，黄芪提取物可通过提高能量供应和代谢物排除等途径达到抗氧化和抗疲劳效果[6]，丹酚酸类化合物在心血管保护、抗肿瘤、抗氧化、抗炎症等方面具有良好效果，其中丹酚酸B抗氧化作用最强，具有良好的抗氧化损伤作用[7]。利佳胶囊是天津天士力制药股份有限公司研发的一款抗氧化保健品，其主要成分便是丹参、黄芪、三七等。丹参成分复杂，除丹酚酸类，还包括丹参酮类、挥发油类化合物及无机元素等。研究表明，丹酚酸B还具有恢复肺气肿大鼠运动能力，降低肺组织氧化损伤和凋亡水平的效果[8]。黄芪不仅能够阻止机体自由基的生成，还能够清除体内过剩的自由基，抑制脂质过氧化，并降低自由基对细胞的氧化程度，延长细胞寿命[9]。因此，我们认为，利佳胶囊可能通过降低运动引起的氧化损伤和炎症反应而产生一定的抗疲劳效果，并结合研究实际，选取了血清尿素氮、游离脂肪酸浓度和血清肌酸激酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶、还原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽活性等指标进行抗疲劳效果评价。
1.1 实验动物
8周龄雄性SD清洁级大鼠（北京维通利华，批号2016-0006）12只，体重（200±20）g，于12 h明-暗交替、室温18～23℃、相对湿度40%～70%的动物房分笼饲养，喂食标准饲料，进食与饮水不作限制。
1.2 实验分组与模型构建
12只大鼠随机分为对照组（Con）和利佳胶囊摄入组（L），参照Z.LIU等[10]大鼠递增负荷运动训练造模方案，构建慢性运动疲劳模型。模型建立分为适应性训练与加强训练两部分，共60天。前30天，大鼠以10 m/min的速度在0坡度跑台跑步，每三天间歇一天，使大鼠充分适应跑步训练。随后进行加强训练，具体方案如表1所示。训练期间，利佳胶囊摄入组采用灌胃方式摄入利佳胶囊，根据厂家推荐使用剂量，以60 mg/kg体重/天（以大豆油溶解）进行灌胃，对照组给以等体积大豆油。最后一次训练完成24 h后，大鼠以20 m/min的速度，在坡度为0的跑台匀速跑，直至力竭，然后恢复24 h，取材检测，评定大鼠慢性疲劳程度。力竭标准为运动末期动物不能坚持原跑速，刺激或驱赶无效，停跑后呼吸急促，神情倦怠，腹卧位，反应迟钝。取材时，大鼠麻醉后心尖取血，用于血清指标检测；
取肝脏和两下肢腓肠肌，一侧腓肠肌部分用于线粒体提取，另一部分经液氮速冻后移入-80°超低温冰箱冻存，另一侧腓肠肌经4%多聚甲醛固定后用于免疫组织学检测。
表1 大鼠慢性运动疲劳模型训练方案Table1 The Exercise Protocol of Chronic Fatigueon Rats
1.3 主要试剂
利佳胶囊是天津天士力制药股份有限公司提供。氧化型谷胱甘肽（glutathione oxidized，GSSG）测定试剂盒、还原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）测定试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）试剂盒、糖原含量检测试剂盒、肌酸激酶（creatine kinase，CK）测定试剂盒、游离脂肪酸（free fatty acids，FFAs）测定试剂盒购自苏州科铭生物技术有限公司；
过氧化氢酶（catalase，CAT）活性检测试剂盒、尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）含量检测试剂盒购自北京索莱宝生物技术有限公司；
线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1）购自碧云天生物科技有限公司；
髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）抗体购自Abcam。其他相关试剂为分析纯。
1.4 疲劳相关指标测定
全血离心取血清，检测血清BUN、FFAs浓度和血清CK活性；
取动物肝脏匀浆液上清检测肝糖原含量，以评价大鼠疲劳状态。
1.5 氧化、抗氧化相关指标测定
全血离心取血清，检测血清CAT、GSH-Px、GSH、GSSG酶活性，并计算GSH/GSSG比值，以评价大鼠机体氧化、抗氧化水平。
1.6 线粒体指标测定
取腓肠肌，置于冰浴表面皿，加入适量线粒体提取介质剪碎，移入匀浆管，冰浴环境下研磨数次，直至无明显组织块。匀浆液于4℃，离心10 min，取上清。再次于4℃，10 000 g离心10 min，取沉淀，用450 μL线粒体保存介质重悬，即得粗制线粒体。以Oxygraph-2K高分辨率细胞呼吸测量仪测定线粒体态Ⅲ呼吸（ST3）和态Ⅳ呼吸（ST4）的呼吸速率，计 算 呼 吸 控 制 率（respiratory control rate，RCR），RCR=ST3/ST4。以JC-1荧光法检测线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential，MMP）变化。
1.7 免疫荧光检测髓过氧化物酶表达
取腓肠肌组织以常规石蜡包埋后切片，厚度为5 µm，将含有完整组织的载玻片于37℃温箱烘干后依次放入二甲苯2次、100%酒精2次、95%酒精、90%酒精、80%酒精、70%酒精中进行脱蜡、水化处理；
清水冲洗后于3%H2O2浸泡10 min，清水洗2次，柠檬酸缓冲液蒸煮3 min，冷却至室温，再次蒸煮冷却后，水洗2次，PBS洗2次，血清封闭；
于37℃温箱中30 min，4℃条件一抗过夜孵育，PBS洗3次，每次5 min，37℃保温箱30 min，37℃HRP标记二抗孵育30 min，清水冲洗后，DAPI复染0.5 min，再次清水冲洗后，依次置于70%酒精、80%酒精、90%酒精、95%酒精、100%酒精2次、二甲苯2次，浸泡2 min；
中性树胶封片后荧光显微镜下观察。
1.8 统计方法
所有数据以平均值±标准差（M±SD）表示，采用GraphPadPrism7.0和SPSS22.0进行独立样本T检验分析，P＜0.05为统计学差异显著，P＜0.01为统计学差异非常显著。
2.1 利佳胶囊对大鼠慢性疲劳运动能力的影响
与Con组相比，L组大鼠经过8周利佳胶囊干预后，力竭运动时间显著延长（P＜0.05），（见图1）。表明利佳胶囊可提高大鼠运动能力。大鼠血清和肝组织指标测试结果显示，与Con组相比，L组慢性疲劳大鼠血清BUN水平显著降低（P＜0.01），FFAs和肝糖原含量均显著增加（P＜0.01），血清CK活性无显著性差异，表明利佳胶囊可有效减轻机体慢性疲劳的产生（见图2）。
图1 慢性疲劳大鼠力竭运动时间比较Figure1 The Exhaustive Exercise Time of Chronic Fatigue Rats
图2 慢性疲劳大鼠力竭运动后抗疲劳指标结果Figure2 The Resultsof Anti-fatigue Indexes of Chronic Fatigue Rats After Exhaustive Exercise
2.2 利佳胶囊对慢性疲劳大鼠抗氧化能力的影响
与Con组相比，L组慢性疲劳大鼠血清CAT活力、GSH-Px活力、GSH/GSSG比值均显著升高（P＜0.01），表明利佳胶囊可有效促进慢性疲劳大鼠机体抗氧化能力（见图3）。
图3 慢性疲劳大鼠力竭运动后抗氧化指标结果Figure3 The Anti-oxidative Ca pacity of Chronic Fatigue Rats After Exhaust ive Exercise
2.3 利佳胶囊对慢性疲劳大鼠骨骼肌损伤的影响
与Con组相比，L组慢性疲劳大鼠骨骼肌的炎性标记物MPO荧光强度较弱，表明利佳胶囊可预防慢性运动损伤（见图4）。
图4 慢性疲劳大鼠力竭运动后骨骼肌MPO荧光染色结果Figure4 The Immun of luorescence Result of MPO in Gastrocnemius of Chronic Fatigue Rats After Exhaustive Exercise
2.4 利佳胶囊干预组对慢性疲劳大鼠线粒体的影响
L组慢性疲劳大鼠线粒体RCR和MMP均显著升高（P＜0.01），表明线粒体呼吸功能和膜结构完整性得到有效保护（见图5）。
图5 慢性疲劳大鼠力竭运动后骨骼肌线粒体呼吸功能和线粒体膜电位结果Figure5 The Mitochondrial Respiratory and Membrane Potential Results of Chronic Fatigue Rats After Exhaustive Exercise
通过外源性补充抗氧化剂的方法，能起到良好的抗疲劳效果，越来越多的消费者也开始追求在饮食中添加天然抗氧化剂以达到减轻氧化损伤和抗疲劳的效果[11]。利佳胶囊在运动干预研究中还未见报道，本研究将其作为运动补剂，观察其对大鼠慢性疲劳产生的影响及在抗疲劳、减轻运动损伤方面的效果，阐释其在改善运动能力中的作用机制。
力竭运动引发的疲劳是一种极度的身体或精神疲倦、虚弱或耗竭感受[12]。力竭跑步时间是身体运动机能的综合表现，不仅可以反应机体的抗疲劳状态，也可以反应抗氧化应激的能力[13]。本研究中，经过8周利佳胶囊干预，慢性运动疲劳大鼠力竭运动时间显著延长，表明利佳胶囊有效提高了慢性疲劳大鼠的抗疲劳水平，增强了运动能力。由此推测，利佳胶囊可能对长时间运动人员，如长跑人群，产生较好的提高运动能力效果。
运动疲劳的产生与血糖降低，能量供给不足密切相关。运动期间，血糖减少，糖原通过磷酸肌酸系统分解代谢为葡萄糖，葡萄糖进一步分解代谢满足机体强烈的能量需求[14]。同时，能量代谢加强又会导致AMPK激活，以应对AMP/ATP和ADP/ATP比率升高，促进有氧代谢和能源消耗[15-16]。在脂肪细胞中，运动诱导β肾上腺素能受体信号通路儿茶酚胺信号增强，促进糖酵解和脂类分解，以维持细胞ATP水平，并使甘油和游离脂肪酸代谢加强以保证运动机体能源需求[17]。因此，糖原储量直接影响机体运动能力。另外，在长时间、大强度运动中，当糖脂代谢无法满足机体需求时，骨骼肌中的蛋白质和氨基酸开始分解参与供能，二者经过脱氨基、转氨基等一系列反应，在肝脏中转变为尿素，导致血液BUN浓度升高[18]。在运动中，ADP磷酸化受限，不能快速合成ATP供能，转化为AMP，而AMP容易发生脱氨基作用产生黄嘌呤核苷酸，也会使血液BUN含量增加[19]。因此，血液BUN水平与运动负荷、身体机能和疲劳程度密切相关。本研究中，经过8周利佳胶囊干预，大鼠肝糖原和血清FFAs明显增加，血清BUN含量显著降低，表明利佳胶囊可能通过提高大鼠肝糖原储备以延长糖代谢供能时间，同时可促进脂肪供能水平以减少糖原利用，起到抗疲劳和提高运动能力的作用。可见，利佳胶囊可能通过促进能量代谢，提高机体供能水平发挥抗疲劳效果，对于日常工作性身体疲劳缓解可能有较好的应用效果。
正常生理状态下，细胞的促氧化系统和抗氧化系统之间保持动态平衡，并调节各种信号反应和代谢活动[20]。急性或大强度运动可通过呼吸、代谢、炎症、免疫反应等多种途径诱导细胞内活性氧水平升高，引发氧化应激，而适当强度的运动则可以增强机体抗氧化能力，消除氧化损伤，提高身体素质[4]。在抗氧化酶系中，CAT是过氧化物酶体的标志酶，可催化过氧化氢分解成氧和水，使机体免受过氧化氢损伤[21]。GSHPx是重要的过氧化物水解酶，能够特异地催化GSH与活性氧反应，生成氧化型谷胱甘肽GSSG，使有毒的过氧化物转换为无毒的羟基化合物，保护细胞免受过氧化损伤[22]。而GSH/GSSG的比值则是体现机体的氧化应激与抗氧化系统平衡状态的重要指标[23]。在本研究中，利佳胶囊摄入组大鼠血清CAT、GSH-Px活性和GSH/GSSG比率均显著升高，表明在慢性运动疲劳进程中，利佳胶囊可激活抗氧化酶体系，提高机体抗氧化能力，减轻慢性疲劳和急性运动引起的氧化应激，起到抗疲劳效果。研究表明，丹参素在缺血再灌注损伤中能激活Akt/ERK1/2/Nrf2信号通路，清除活性氧，提高CAT、GSH-Px等抗氧化酶活性，增强机体的抗氧化防御系统[24]。由此，利佳胶囊可能作为日常补剂，在抗氧化、抗衰老、慢病治疗等方面有较好的应用前景。
疲劳状态下，机体运动能力下降，则容易引起运动损伤。肌酸激酶同工酶CK-MM是肌肉特异性酶，可催化磷酸肌酸和ADP之间的高能磷酸键转换，生成ATP和肌酸，在能量运转、肌肉收缩和ATP再生中有重要作用[25]。MPO是由中性粒细胞、单核细胞和某些组织的巨噬细胞分泌的含血红素辅基的血红素蛋白酶，是血红素过氧化物酶超家族成员之一，是评价组织氧化损伤的重要指标[26]。本研究中，利佳胶囊摄入组大鼠血清CK活性较对照组无显著性差异，但MPO免疫荧光结果显示，利佳胶囊摄入组大鼠骨骼肌MPO荧光强度明显较弱，因此，可以认为，利佳胶囊可在一定程度上减弱慢性运动疲劳致骨骼肌损伤程度，减轻炎症反应。
线粒体是细胞能量主要来源，在运动过程中调节细胞ATP供能、活性氧产生、钙信号等多种生命活动，维持机体正常功能。钙超载、线粒体膜电位下降、氧化应激等刺激可促使线粒体膜电位开放，当线粒体膜通透性发生变化时，线粒体内膜通透性增强，氢离子等可通过内膜进入线粒体，消除质子电化学梯度，抑制ATP的产生[27]。在本研究中，利佳胶囊摄入组大鼠骨骼肌线粒体RCR和MMP显著高于对照组，说明经过8周干预，利佳胶囊有效增强了慢性运动疲劳大鼠骨骼肌线粒体呼吸能力，保护了线粒体功能，保证了机体供能水平，提高运动能力。
在本研究中，我们关注的是慢性疲劳大鼠在力竭运动后的疲劳缓解状态，在实验分组上相对较为单一，后期将考虑增加单纯慢性疲劳鼠的机体机能状态变化和急性力竭运动后即刻机能变化，从而观察多种运动状态下的干预效果。在疲劳/抗疲劳研究中，肌肉力量下降程度是最为直观的疲劳判定指标之一，而在研究过程中由于实验条件有限，并未检测大鼠下肢肌群及肌纤维收缩力量变化，在今后相关研究中将增加肌力指标的测试，以便提供更加全面的结果。另外，本研究在探讨利佳胶囊缓解运动疲劳中的抗氧化效果时，未直接检测骨骼肌活性氧变化情况，只检测了氧化/抗氧化酶的变化，后期在相关研究中可以增加这一指标，获得更为直观的效果。
综上，利佳胶囊可有效提高大鼠力竭运动能力，并可通过提高大鼠能量代谢水平和抗氧化、抗损伤水平起到抗疲劳效果。提示利佳胶囊可能作为运动补剂，提高长时间、大强度运动人员运动能力；
也可能作为日常营养补充剂，在改善工作性疲劳、提高机体抗氧化、抗衰老水平及慢病治疗中具有一定的应用前景。
利佳胶囊可以增强大鼠骨骼肌抗氧化能力，保护线粒体功能，降低大鼠骨骼肌损伤，从而对大鼠的慢性运动性疲劳产生良好的抵抗效果。
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