赵学志，丁云花，张俊倩，唐小燕，宋曙辉
（1. 北京市农林科学院农产品加工与食品营养研究所，北京 100097；
2. 果蔬农产品保鲜与加工北京市重点实验室，北京 100097；
3. 北京市农林科学院 蔬菜研究所，北京 100097）
马齿苋为一年生草本植物，世界各地均有分布。其抗病性强，对土壤和环境要求不高，易于生长，产量高。马齿苋为药食两用植物资源。在欧洲地中海沿岸，作为日常食用蔬菜，同时具有利尿、退热、杀菌、抗痉挛、杀虫作用及抗胆碱酯酶活性[1-2]。我国将马齿苋作为传统中药也有很长的历史。在“本草纲目”中记载马齿苋具有抗炎消肿等功效。现代药理学研究表明，马齿苋还具有降血糖、调节血脂、抗炎、抗氧化等功能[3-6]。马齿苋营养丰富，富含ω-3 脂肪酸，特别是α -亚麻酸含量，是植物资源中含量较高之一[7]，其ω-6/ω-3 小于2，有利于人体对脂肪酸的平衡和利用，起到预防心血管疾病发生的作用[8]。另外，含有抗坏血酸、类胡萝卜素、铁等矿质元素，且含有黄酮、酚酸、多糖、生物碱、马齿苋酰胺等功能性成分[9-11]。近几年，栽培型马齿苋作为一种新型蔬菜逐渐走进餐桌。栽培型马齿苋株型大、直立、产量高[12]，同样富含多种营养功能性成分[13]。以往的研究多以野生型马齿苋为主[14]。针对栽培型马齿苋的功能成分及抗氧化功能进行试验，为栽培型马齿苋的开发积累理论和试验基础。
1.1 材料
栽培型马齿苋，蔬菜中心实验农场种植。分别在苗期G1、G2、营养生长期G3、现蕾期G4 和成熟期G5、G6 取样。
1.2 试剂
辣根过氧化物酶（HRP）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-pierylhydrazy；
DPPH）、肌红蛋白（Myoglobin）、ABTS （2,2"-Azinobis（3-ethyl benzothiazoline 6-sulphonate）、黄嘌呤（Xanthine）、黄嘌呤氧化酶（XOD），Sigma 公司提供；
萘乙二胺（NED）、对氨基苯磺酸、过氧化氢、L -酪氨酸、氢氧化钠、双氧水、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、无水乙醇，均为国产分析纯。
1.3 仪器
KQ-600DE 型超声波振荡仪，昆山市超声仪器有限公司产品；
20A 型高效液相色谱仪，日本岛津产品；
HITACHI U-3410 型紫外分光光度计；
LD5-2B 型离心机，北京京立离心机有限公司。
1.4 样品制备
取新鲜马齿苋，去掉老叶、黄叶，清洗后切分，真空冷冻干燥后粉碎并过60 目筛。按相应的方法称取冷冻干燥马齿苋粉进行分析。抗氧化试验，称取马齿苋冷冻干燥粉5.0 g，按1∶20 加入70%乙醇作为提取剂，超声波提取30 min，以转速3 500 r/min离心20 min 后取上清液，样品质量浓度以每毫升溶液中干物质含量表示。
1.5 试验方法
1.5.1 功能成分检测
叶绿素测定参照NY/T 3082—2017；
类胡萝卜素测定参照文献[15]；
总黄酮测定采用硝酸铝比色；
总酚测定采用Folin 酚比色法[16]；
多糖测定参照功能食品中多糖的检测方法[17]。
1.5.2 抗氧化活性[18]
（1） DPPH·试验。称取DPPH，用无水乙醇配成浓度为2×10-4mol/L 的溶液，冷藏于冰箱中。
DPPH·试验加样表见表1。
表1 DPPH·试验加样表
用力摇匀，将Ai所表示的样品在室温下静置30 min 后，加入1 cm 比色皿中进行吸光度的测定，测出A0、Ai、Aj的吸光度，按下列公式进行清除率的计算。
（2） ABTS-肌红蛋白- H2O2系统。将磷酸盐缓冲液、马齿苋提取液、ABTS、 肌红蛋白按顺序加入1 mL 比色皿中，每个浓度做5 个平行样，再带1 份试剂空白，然后于分光光度计前，在5 个平行样中分别加入过氧化氢，空白中不加过氧化氢，迅速混匀后，放入样品池中，置于30 ℃恒温条件下，于波长734 nm 处测定吸光度。
（3） Xan-XOD 试验系统。在总体积1 mL 的溶液中含有：100 mmol/L 磷酸缓冲液pH 值7.4，1 mmol/L盐酸羟胺（HONH2.HCl），500 mol/L 黄嘌呤，0.04 U/mL黄嘌呤氧化酶。将磷酸缓冲液、羟基氯化铵、黄嘌呤，不同浓度的马齿苋提取液以及XOD 依次加到1 mL 具塞塑料离心管内，盖紧盖后，放到37 ℃水浴振荡，培养30 min。水浴期间，准备好相应的微量比色皿，并分别加入质量分数为1%的对氨基苯磺酸溶液0.3 mL，水浴结束后，迅速加入反应液0.3 mL和0.02%的NED 0.3 mL。在紫外-可见分光光度计上，于波长540 nm 处分别测定吸收度。
（4） 酪氨酸-二酪氨酸（Tyr/di-Tyr） 系统。在玻璃试管内依次加入磷酸盐缓冲液、酪氨酸，不同浓度马齿苋提取液，过氧化氢和HRP，37 ℃水浴振荡60 min 后，取出，立即用1mol/L HCl 溶液终止反应，于HPLC 测定酪氨酸和二酪氨酸含量。
反应原理见图1。
图1 反应原理
HPLC 条件：1 色谱柱：Diamond 250 mm×4.6 mm；
2 流动相：A 液：50 mmol/L 磷酸盐缓冲液pH 值2.4；
B 液：甲醇100%；
梯度洗脱程序：B 液浓度由1 min 时的0 线性渐变到6 min 的30%，再渐变到10 min 的0，保持8 min；
检测波长285 nm；
流速1.0 mL/min；
进样量20 μL。
1.6 数据统计
每组试验进行3 次重复，结果以X±SD 表示。采用SPSS 19.0 进行相关性分析、方差分析。
2.1 马齿苋不同采收期功能成分的变化
不同生长期马齿苋功能成分含量见表2，马齿苋不同生长期功能成分的变化见图2。
表2 不同生长期马齿苋功能成分含量 / mg·g-1 DW
图2 马齿苋不同生长期功能成分的变化
植物中的功能成分主要为次生代谢产物，其合成的多少受基因型及外界环境影响较大。幼嫩组织生长旺盛，多酚合成代谢大于分解代谢，且旺盛生长的器官中生长素的含量较高，贮存器官中酚类化合物调运迅速[19]。多数研究表明植物幼嫩组织中多数酚类物质的含量显著高于成熟组织[20-21]。由图2 可知，马齿苋的多酚和黄酮含量都表现为苗期至营养生长期最高。
由表2 和图2 可以看出，除多糖外，其他几种功能成分均表现为苗期和营养生长期含量高，之后逐渐下降。不同功能成分在生长不同时期呈现出较大差异。总黄酮含量最大相差5.2 倍，多酚相差3.3倍，类胡萝卜素相差4.6 倍，叶绿素相差4.5 倍，多糖相差2.0 倍。
2.2 马齿苋不同生长期抗氧化活性变化
马齿苋不同生长期4 种抗氧化方法的IC50值见表3。
表3 马齿苋不同生长期4 种抗氧化方法的IC50 值 / mg·mL-1
试验中所采用的4 种抗氧化方法，分别从不同的机理来表明抗氧化能力。DPPH 自由基清除评价方法是目前最常用的抗氧化方法，简便且易于大量筛选抗氧化活性，可作为初步筛选的方法。ABTS 方法与DPPH 自由基清除方法相似，但灵敏度更高。另外2 种抗氧化方法，模拟了体内自由基产生途径和清除机理，酪氨酸方法模拟体内大分子蛋白质受损的过程，Xan-XOD 方法模拟缺血再灌注后产生的自由基，有一定的生物学意义。4 种抗氧化方法都显示了马齿苋在营养生长期抗氧化活性较高。苗期的抗氧化活性最高，尤以播种后22 d，此时苗龄20 d，4 片真叶，为马齿苋苗生长旺盛期。结果显示，马齿苋在不同生长时期的抗氧化性能有很大差异。Xan-XOD 法相差10 倍，DPPH 相差5.5 倍，ABTS 法相差4.2 倍，酪氨酸/二酪氨酸法相差3.5 倍。
2.3 马齿苋功能成分含量与抗氧化活性的相关性
马齿苋功能成分含量与抗氧化能力的相关性（R） 分析见表4。
表4 马齿苋功能成分含量与抗氧化能力的相关性（R） 分析
由表4 可以看出，马齿苋中几种功能成分都与抗氧化活性呈正相关，即与IC50值呈负相关，但未达到显著性差异（p＞0.05）。植物中的多酚类化合物是公认的具有很强抗氧化活性的次生代谢产物，可清除体内过剩的自由基，防止DNA、蛋白质和脂质等生物大分子氧化损失，从而预防癌症、糖尿病等疾病的发生[22-23]。多羟基酚酸能够清除几乎所有类似自由基的氧化剂分子。试验中可以看出，多酚和黄酮对抗氧化活性贡献较为明显，其含量与抗氧化性呈正相关。叶绿素的贡献最小。类胡萝卜素居中。多酚含量与黄酮，多酚与类胡萝卜素，类胡萝卜素与叶绿素含量呈极显著正相关（p＜0.01），黄酮与类胡萝卜素、黄酮与叶绿素、多酚与叶绿素呈显著正相关（p＜0.05）。4 种抗氧化方法之间，Xan-XOD 法和DPPH 和ABTS 呈 极 显 著 正 相 关（p＜0.01），Xan-XOD 法和酪氨酸法呈显著正相关（p＜0.05）。酪氨酸法和DPPH 和ABTS 呈极显著正相关（p＜0.01），DPPH 和ABTS 法呈显著正相关（p＜0.05）。
针对栽培型马齿苋的几种功能成分进行分析，并采用4 种抗氧化方法进行抗氧化活性评价。结果表明，马齿苋各功能成分及抗氧化活性在不同生长期呈现动态变化。
试验结果中，功能性成分与抗氧化活性呈现一定的正相关性。除多糖外的几种功能成分都表现为苗期含量高，抗氧化试验结果也同时显示出抗氧化活性在苗期最高。在相关性分析中可以看出，4 种抗氧化方法之间为显著及极显著正相关。
试验中多糖的含量与抗氧化性能为负相关（结果未列出），多糖提取的步骤之一为醇沉，试验采用的是70%乙醇为提取剂，此种情况下，多糖沉淀无法提取出来，因而结果不能真正表明多糖的抗氧化性能。这也从反面证实了抗氧化性能与功能成分之间的相关性。其他几种功能成分在醇相条件下可以提出，因而可以反映与抗氧化性能的关系。
试验结果表明，马齿苋营养生长期相较于苗期产量高，功能性成分相对较高，抗氧化性能好，在兼顾功能成分及商品性时，马齿苋的最佳采摘期为营养生长期，这也是马齿苋的最佳食用时期，适口性最好。待进入现蕾生长期，尽管可以食用，但口感外观等商品性能下降。栽培过程中可以采取适当措施推迟现蕾开花，达到积累功能成分的目的。试验结果可以为栽培型马齿苋的开发利用提供一定的参考。
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