周建设，扎西拉姆，王万良，孙帅杰，张 驰
( 1.西藏自治区农牧科学院 水产科学研究所，西藏 拉萨 850032；
2.河南农业大学 动物科技学院，河南 郑州 450002 )
季节性繁殖周期包括性腺组织的年再生，主要由激素调节途径介导[1]。越来越多的证据表明，节律性和繁殖行为是互相关联的，生物钟定时系统通过激素和神经途径影响多种生理系统，生物钟基因表达的中断会导致动物模型的繁殖行为和代谢变化，生物钟还影响着多种生殖激素的血清浓度[2]。鱼类同其他脊椎动物一样，生殖腺的发育是周期性的，特定地区每年的繁殖季节固定，这便是鱼类季节性的繁殖行为[3]。异齿裂腹鱼(Schizothoraxo′connori)属裂腹鱼亚科，广布于雅鲁藏布江[4]，在中国脊椎动物红色名录中被评估为“无危种”，但其近缘物种如巨须裂腹鱼(S.macropogon)、拉萨裂腹鱼(S.waltoni)等被评估为“易危种”[5]。异齿裂腹鱼集群产卵期为每年的3—5月[6]，表现出明显的季节性繁殖行为。已有大量的研究证实，鱼类繁殖行为存在节律的变化[7-8]。
Clock基因是生物钟基因的核心基因，被认为是自然选择塑造日节律以及与动物繁殖等生活史特性有关的潜在目标基因[9]。Clock基因为节律振荡器编码出Clock蛋白，在Clock蛋白的氨基酸序列中存在多个保守序列，包括C端富含谷氨酰胺(Q)的结构域(Poly-Q)[10]，这个谷氨酰胺富集区起着转录激活的作用，同时C端谷氨酰胺重复区域的长度决定了Clock蛋白的转录激活潜能[11]，因此，它可以影响与动物昼夜节律相关的行为和生理功能[12- 13]。
研究表明，在各种有机体中，一切生理和行为都是由生物钟控制的节律性活动[14]，大脑以外广泛组织生物钟基因转录因子的发现，表明细胞节律性可能具有更广泛的生物学意义[14]。研究发现，Clock基因在小鼠妊娠后期的子宫胎膜和胎盘中表达，可以调控小鼠的发情周期和妊娠情况[15-16]，在家禽中Clock等节律基因能够通过促黄体生成素调控鸡的排卵时期，同时在鸡胚胎发育过程也发挥作用[17-18]。也有研究表明，马岗鹅产蛋高峰期Clock基因表达水平在“下丘脑-垂体-性腺”轴组织中均高于休产期和就巢期[19]。鱼类的生殖系统发育和繁殖性能跟禽类一样，主要受性腺轴调控[20-21]，表明Clock基因可能在调控鱼类的繁殖周期节律变化方面发挥重要作用。异齿裂腹鱼在繁殖行为上表现出明显的节律性，Clock基因在其季节性繁殖中的调控作用有待于进一步研究。
笔者以雅鲁藏布江中的异齿裂腹鱼为研究载体，克隆异齿裂腹鱼Clock基因全长cDNA，分析其组织表达特征，旨在探明Clock基因的组织表达模式，为从理论上揭示青藏高原裂腹鱼Clock基因在季节性繁殖生理上的作用提供基础数据。
1.1 试验材料
试验用异齿裂腹鱼于2019年2—3月采自雅鲁藏布江拉萨流域，这个季节雅鲁藏布江拉萨流域异齿裂腹鱼即将进入繁殖季节，性腺大多处于Ⅳ期[6]。该阶段被认为是人工激素诱导排卵的最佳阶段，这个阶段伴随着卵母细胞核和细胞质的几个成熟过程，直到Ⅴ期卵母细胞成熟，包括生发囊泡的破裂、染色体凝聚、减数分裂纺锤体的组装和第一极体的形成，并受到促性腺激素(促黄体生成激素、促卵泡成熟激素)、成熟诱导激素和成熟促进因子的调控，也是性腺发育过程中变化最大的一个阶段[22]。
试验鱼用鱼苗袋充氧运回实验室，放入经过清洗消毒处理的水泥池暂养过夜后，用三卡因间氨苯酸乙脂甲磺酸盐(鱼安定)麻醉后解剖判定性腺发育情况，为避免性别和年龄对试验的影响[23]，挑选体质量(1.42±0.23) kg、体长(36.34±0.34) cm的雌性个体3尾和体质量(0.93±0.56) kg、体长(28.44±0.31) cm雄性个体3尾，性腺发育均处于Ⅳ期健康的异齿裂腹鱼，采集心脏、脾脏、性腺、肝脏、肌肉和脑组织保存在液氮中，用于Clock基因全长克隆和组织分布研究。
1.2 RNA提取及cDNA合成
按Trizol提取试剂盒(上海生物工程)说明提取样本总RNA，经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测后，每个样本取1 μL RNA用U-3010紫外-可见分光光度计测定其浓度，要求1.8
1.3 异齿裂腹鱼Clock基因cDNA的克隆
1.3.1 引物设计
以异齿裂腹鱼全长转录组测序结果(PRJ NA527715)调取Clock基因编码序列设计特异性引物，引物序列见表1。
表1 引物名称及序列
1.3.2 Clock基因cDNA全长的克隆
以3′adaptor为反转录引物的cDNA为模版，进行巢式PCR，反应体系见表2，反应程序见表3。以特异性引物RC595-RT1/RC595-RT2反转录，得到cDNA，经RNase H和TdT处理后，进行巢氏PCR，反应体系见表2，反应程序见表3。
表2 3′RACE和5′RACE反应体系 μL
表3 PCR反应程序
巢式PCR结果以1%琼脂糖凝胶电泳观察结果。目的片段连接转化后，将克隆送上海生物工程测序，测序结果用软件DNAMAN 8.0拼接。
1.4 异齿裂腹鱼Clock基因组织分布特征
雌、雄异齿裂腹鱼各3尾采集的心脏、脾脏、性腺、肝脏、肌肉和脑组织，按1.2所述合成cDNA，使用Oligo软件设计特异性引物(clock-qPCR-f：5′-GCCACCTTCGCACAAGACC-3′；
clock-qPCR-r：5′-ATAACTGCACCACACGCCAT-3′)，并以异齿裂腹鱼β-actin序列设计内参引物(β-actin-f：5′-CCCAGAGGAGCACCCCGTC-3′;β-actin-r：5′-AC GACCAGAGGCATACAGGGACA-3′)进行实时荧光定量反应。实时荧光定量反应体系为20 μL，其中：2×SYBR©Premix Ex TaqTM10 μL，引物(样本引物：clock-qPCR-f和clock-qPCR-r；
内参引物：β-actin-f和β-actin-r)各0.5 μL(10 μmol/L)，cDNA模板1 μL，ddH2O 8 μL。反应程序为：95 ℃预变性1 min；
95 ℃变性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，45个循环。每个样品设置3个技术重复，以缩小系统误差。
1.5 数据处理与分析
实时荧光定量结果采用2-ΔΔCt法分析，Clock基因各组织相对表达量的定量结果通过SPSS 16.0软件进行处理，显著性检验采用单因素方差分析，P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著，P>0.05为差异不显著。
1.6 系统进化树
使用MEGA 6.0，邻接法构建异齿裂腹鱼Clock蛋白系统进化树，检验各分支的置信度用自举法重复1000次。
2.1 异齿裂腹鱼Clock基因cDNA的克隆
通过cDNA末端快速扩增技术获得异齿裂腹鱼Clock基因cDNA 5′端和3′端(图1)。拼接后Clock基因cDNA全长为4291 bp，5′非编码区为539 bp、3′非编码区为1046 bp、编码区为2706 bp，异齿裂腹鱼clock基因cDNA全长已上传至Genbank数据库(MT774361)。异齿裂腹鱼Clock基因cDNA序列含有起始密码子ATG及3′端Poly(A)结构，表明克隆到的异齿裂腹鱼Clock基因核苷酸信息完整。
图1 巢式PCR电泳结果
2.2 异齿裂腹鱼Clock基因及蛋白序列分析
异齿裂腹鱼Clock基因共编码901个氨基酸(图2)，所编码的氨基酸与其他脊椎动物Clock蛋白一样，在末端具有典型的Poly-Q结构。与其他鱼类相比，异齿裂腹鱼和尖裸鲤(Oxygymnocyprisstewarti)的Clock蛋白存在大片段的插入，尤以尖裸鲤为典型。通过美国国家生物技术信息中心的BLAST分析，选取白甲鱼(Onychostomamacrolepis)、金鱼(Carassiusauratus)、抚仙金线鲃(Sinocyclocheilusgrahami)、斑马鱼(Daniorerio)等18种鱼Clock蛋白的氨基酸序列构建邻接树(图3)，与物种进化程度一致，异齿裂腹鱼Clock蛋白与白甲鱼Clock蛋白具有较高的同源性。
图2 异齿裂腹鱼Clock基因推导的氨基酸序列
图3 异齿裂腹鱼Clock基因推导的蛋白序列与近源种系统进化树
2.3 异齿裂腹鱼Clock基因在不同组织中的表达情况
采用实时荧光定量检测Clock基因在异齿裂腹鱼心脏、脾脏、性腺、肝脏、肌肉和脑中的表达分布情况，结果见图4，其中，性腺组织的Clock基因表达量在雌鱼和雄鱼间差异显著(P<0.05)，肌肉、全脑、肝脏、心脏和脾脏组织的Clock基因在雌、雄个体间差异不显著(P>0.05)，除心脏组织的Clock基因相对表达量雄鱼高于雄鱼外，其他组织的相对表达量均表现为雌鱼高于雄鱼。在雌鱼中，性腺和肌肉、全脑和肝脏、心脏和脾脏组织中Clock基因的相对表达量差异不显著(P>0.05)，其余组织之间表达量差异极显著或显著(P<0.01，P<0.05)。以性腺中的相对表达量最高，显著高于其他组织的相对表达量；
其次为肌肉组织，其相对表达量显著低于性腺组织，显著高于其他组织；
全脑中的相对表达量显著低于性腺和肌肉，显著高于脾脏和心脏。在雄鱼中，肝脏和心脏、肝脏和全脑、心脏和全脑、性腺和肌肉中Clock基因相对表达量差异不显著(P>0.05)，其余组织之间表达量差异极显著或显著(P<0.01；
P<0.05)；
以性腺中的相对表达量最高，显著高于除肌肉外的其他组织；
脾脏组织相对表达量最低，显著低于其他组织。
图4 异齿裂腹鱼Clock基因在不同组织中的表达情况
3.1 异齿裂腹鱼Clock基因结构特征
Clock基因是产生生物节律的核心基因[24-25]，异齿裂腹鱼Clock基因编码的Clock蛋白分子式为C4389H6978N1278O1405S37，为疏水性蛋白，与多个时钟相关的蛋白互作，在物种进化上与抚仙金线鲃Clock蛋白具有较高的同源性[26]，笔者通过构建邻接系统进化树发现，异齿裂腹鱼Clock蛋白与白甲鱼Clock蛋白在进化上有较近的关系，其次为金线鲃属鱼类。武云飞[27]通过对裂腹鱼类和鲃亚科鱼类的外部形态、主要骨骼结构进行详细比较后，认为裂腹鱼类与鲃亚科鱼类有着极近的亲缘关系。本研究中，克隆到的Clock基因cDNA全长4291 bp，编码区为2706 bp，编码901个氨基酸；
金线鲃鱼类Clock基因编码区全长2676 bp，编码892个氨基酸，与其他物种Clock蛋白相似。异齿裂腹鱼Clock蛋白在C端富含谷氨酰胺(Q)的结构域(Poly-Q)，共有44个谷氨酰胺；
金线鲃Clock蛋白C端共有45个谷氨酰胺。有些物种的Ploy-Q长度随纬度梯度的变化而变化，重要的是Poly-Q长度和纬度梯度变化与繁殖启动的时间相关，纬度越高，Poly-Q长度相对较长[28]。有研究表明：Clock蛋白Poly-Q片段越短，亚洲短趾百灵(Calandrellaoheleensis)产卵开始的时间越早；
而Poly-Q片段越长，产卵开始时间越晚[29]。O′Malley等[30]研究指出，Clock基因的变异拷贝数在秋季和春季产卵的大鳞大麻哈鱼(Oncorhynchustshawytscha)之间频率显著不同。异齿裂腹鱼集中产卵时间集中在每年的3—5月，即使同一栖息地的异齿裂腹鱼产卵时间也不尽相同，在个体水平上，鱼类同一种群内的不同个体繁殖时间也有差异，这便是表型多态性[29]。表型的多态范围可能是物种应对环境变化的适应[31]。从异齿裂腹鱼分布范围来看，雅鲁藏布江下游群体产卵开始时间早于中游和上游，这是由不同江段的水温决定的，水温越高产卵开始时间就越早[6]。而实际上，在同一江段群体中，虽然具有比较一致的温度环境，但个体的产卵时间也有差异。因此，探讨鱼类生殖节律表现出来的个体差异是否与内在的遗传机制有关，对于了解鱼类季节性繁殖行为能否通过微进化的方式应对环境变化具有现实意义[29]。异齿裂腹鱼个体之间繁殖启动时间的差异可能与Clock基因所编码的蛋白C末端Poly-Q长度的变异有关，Poly-Q在许多转录因子的转录激活中起作用[32]。同时，值得注意的是，通过比较几种鱼类Clock基因所编码的蛋白序列时发现，与其他鱼类相比，异齿裂腹鱼和尖裸鲤的Clock蛋白存在大片段的插入，尤以尖裸鲤为典型。曹文宣等[33]将裂腹鱼亚科鱼类划分成适应于高原环境的3个特化等级，其中裂腹鱼属为原始等级，尖裸鲤属为高度特化等级。不同等级的3个类群分布的海拔与每次高原隆起后达到的高度大体一致。从资源调查的结果看[34]，尖裸鲤的分布范围最窄，仅在雅鲁藏布江的仁布江段以上采集到，而异齿裂腹鱼在整个雅鲁藏布江中游均有分布。提示Clock蛋白在尖裸鲤和异齿裂腹鱼中大片段的插入可能是为了适应高海拔某些条件而特化的。
3.2 异齿裂腹鱼Clock基因组织表达特征
Clock基因广泛分布于动物的各个器官组织中。笔者通过实时荧光定量PCR技术检测了Clock基因在异齿裂腹鱼雌、雄个体肝脏、脾脏、心脏、脑、性腺和肌肉中的表达情况。Clock基因在雌、雄异齿裂腹鱼以上组织中都有表达，这一结果与其他物种(小鼠[35]、果蝇[36]、斑马鱼[37]和人[38])的研究结果一致。在果蝇中，自主的生理节律振荡器存于全身[39]，说明异齿裂腹鱼中心生物钟和外周生物钟也是同时存在的。本研究中，Clock基因在雌、雄个体性腺中的表达量均显著高于其他组织，表明相对其他组织而言，Clock基因可能在调节异齿裂腹鱼的繁殖方面发挥作用。也有研究证实，Clock基因的突变会打乱小鼠的发情周期[40]；
Clock基因的突变可影响雌性果蝇的生殖健康和减少雄性果蝇精子输出量[41]；
Clock基因的突变可能会通过改变生物体对日节律的感知而对发情周期产生多重效应，进而影响交配时间[42]；
通过候选基因定位方法，对虹鳟(Oncorhynchusmykiss)产卵时间的QTL数据集进行分析发现，Clock基因明显定位于虹鳟产卵时间的QTL区域内[43]。Clock基因在异齿裂腹鱼性腺中的高表达进一步提示，异齿裂腹鱼繁殖时间在性腺决定的基础上，还受Clock基因的微调影响。这种调控可能与其产卵开始时间关联，而异齿裂腹鱼Clock基因Poly-Q长度的变异与其繁殖启动时间是否存在特定关系，及异齿裂腹鱼Clock基因在不同季节各组织中的表达特征等，还有待进一步开展的工作。本研究中，异齿裂腹鱼雌鱼和雄鱼肌肉组织中Clock基因的表达量仅次于性腺组织且差异不显著，但极显著高于其他组织，这一结果与同样重要的内源性生物钟基因之一的Timeless基因在中华绒螯蟹(Eriocheirsinensis)[44]成蟹时期的表达情况一致，Timeless基因在成蟹时期的脂类储存和脂类加工的重要器官中大量表达，以有效调控中华绒螯蟹在生殖洄游过程中的能量分配。鱼类的繁殖是一个耗能过程，而肌肉组织是机体贮存能量的重要场所，在功能上主要承担机体能量代谢、运动、有氧呼吸等[45]，在鱼类繁殖过程中尤其是雌性个体，肌肉和性腺组织生物过程上的某些同步性是繁殖过程中能量供给的保障。Clock基因在雌鱼性腺中的表达量显著高于雄鱼性腺，也进一步说明Clock基因在鱼类的繁殖过程中对雌鱼的调控作用更加显著。在生物钟环路中，Clock基因编码的蛋白与Bmal1基因编码的蛋白形成异源二聚体，在时钟基因调控网络中起到正向调控作用[46-48]，谢伟等[49]关于克氏原螯虾Cyc基因(Bmal1基因在脊椎动物中的同源基因)的研究结果表明，Clock基因与Bmal1基因具有相似的mRNA表达水平，并受脑组织的支配，这与本研究中Clock基因在雌、雄鱼全脑组织中相对表达量虽然差异不显著，但雌鱼高于雄鱼的趋势明显这一结果基本符合，说明Clock基因在调控鱼类繁殖节律的过程中受脑组织的支配。
笔者克隆了异齿裂腹鱼Clock基因cDNA全长，其所编码的氨基酸在末端具有典型的Poly-Q结构；
Clock基因在异齿裂腹鱼雌、雄个体的肝脏、脾脏、心脏、脑、性腺和肌肉中均有表达，雌、雄鱼均是以性腺中的相对表达量最高，进一步提示Clock基因可能在异齿裂腹鱼的繁殖过程中发挥更大的作用；
推测异齿裂腹鱼Clock蛋白C末端Poly-Q的长度的变异可能与其产卵开始时间关联；
Clock蛋白大片段的插入可能是为了适应高海拔某些条件而特化的。研究结果可为揭示青藏高原裂腹鱼Clock基因在季节性繁殖生理上的作用提供科学依据。