吕艳敏，花 梅，张晓明，穆瀛通，李晓杰，郝 宁，奥 运，王俊杰
(内蒙古农业大学草原与资源环境学院，内蒙古 呼和浩特 010019)
种子是农业生产中的基本资料，其质量的好坏直接关系到后期饲草的产量和品质[1]。种子也是植物种质资源长期保存的理想材料，而种质资源能够长期保存是品种改良的前提[2]。即使在最佳条件下长期贮藏，种子活力也不可避免地会持续下降。种子老化是一个累积不可逆转的过程。不同贮藏条件下，随贮藏时间的增加，种子逐渐老化，使得种子发芽率[3]、发芽势[4]、发芽指数[5]、活力指数[6]降低甚至丧失，幼苗的生长也会受到抑制[7]，对农业生产和种质资源更新均有严重影响[8]。大量研究表明，膜完整性丧失、酶降解、呼吸减弱、遗传物质降解等是种子发生老化的主要生理表现[9-12]，其中，抗氧化酶作为细胞内的自由基清除剂，能够降低种子老化过程中自由基对种子细胞膜的攻击，使得细胞膜脂质的过氧化作用降低，从而降低种子老化速率[2]。近年来，已有学者对披碱草(ElymusdahuricusTurcz.)、烟草(NicotianatabacumL.)、菊苣(CichoriumintybusL.)、油松(PinustabuliformisCarr.)等种子老化进行较系统的研究，发现种子老化会破坏其细胞膜的完整性，加深其脂质过氧化损伤程度，抗氧化酶及呼吸关键酶的活性下降，进而导致种子活力降低[13-16]。目前，关于贮藏时间对白三叶种子活力及生理生化特性变化规律的研究鲜有报道。白三叶(TrifoliumrepensL.)是一种营养价值高、草质细嫩、产量高的优质豆科牧草[17-18]，且植株低矮、再生能力强，在国内外城市绿化、水土保持、生态环境保护中具有重要地位[19]。本研究中的白三叶新品系是内蒙古农业大学王俊杰教授团队以野生白三叶为原始材料，通过人工栽培驯化选育而成的，具有较强的抗寒性，可在内蒙古地区大面积推广种植，解决白三叶在内蒙古地区无法越冬的问题。本试验以贮藏0～5年的白三叶新品系种子为试验材料，通过测定种子萌发指标、幼苗生长及生理指标，探讨白三叶种子老化规律，以期为白三叶种质资源的安全保存和在实际生产中提高种子质量提供理论基础。
1.1 试验材料
白三叶新品系是内蒙古农业大学王俊杰教授团队以内蒙古大兴安岭山区野生白三叶为原始材料，经多年多代人工栽培、驯化、系统选育而成的耐寒型白三叶。供试材料种子产自内蒙古农业大学试验田，分别于2021，2020，2019，2018，2017，2016年收获，置于种子储藏柜中避光贮藏(恒温4℃、湿度30%)。分别在贮藏0，1，2，3，4，5年后进行发芽试验和生理指标的测定。
1.2 种子萌发及幼苗生长指标的测定
使用5%的NaClO溶液对种子消毒10 min，蒸馏水反复进行冲洗，滤纸吸干水分备用。将100粒种子均匀放入铺有两层滤纸的培养皿(d=12 cm)中，再将培养皿置于20℃人工智能培养箱中恒温培养，4次重复。以胚根突破种皮视为发芽种子，每日统计发芽的种子数量，第4 d计算发芽势(Germination potential，GP)。于第10 d统计发芽率(Germination rate，GR)、发芽指数(Germination index，GI)和活力指数(Vigour index，VI)，测定幼苗的芽长(Bud length，BL)、根长(Root length，RL)以及鲜重(Fresh weight，FW)。
活力指数(VI)=GI×FW[1]
其中，式中，Gt为t日的发芽种子数，Dt为相应的发芽天数。
1.3 种子相对电导率、抗氧化酶及呼吸关键酶活性的测定
相对电导率的测定：参照郝楠等[21]的方法，分别从不同贮藏年限中选取种皮完整的种子100粒，称重后放入烧杯中，加入250 mL去离子水，用电导仪测定初始电导率；
用保鲜膜将烧杯封口，室温下静置24 h,测量种子浸出液电导率，3次重复取平均值。
抗氧化酶活性的测定：超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)活性采用氮蓝四唑法[22]测定,过氧化物酶(Peroxidase，POD)活性采用愈创木酚法[22]测定,过氧化氢酶(Catalase，CAT)活性采用高锰酸钾滴定法[22]测定，3次重复取平均值。
呼吸关键酶活性的测定：细胞色素C氧化酶(Cytochrome coxidase，COX)和异柠檬酸脱氢酶(Isocitrate dehydrogenase，ICDH)活性采用分光光度法[22]测定；
酸性磷酸酶(Acid phosphatase，APA)活性采用比色法[23]测定；
苹果酸脱氢酶(Malate dehydrogenase，MDH)活性采用紫外吸光光度法[24]测定，3次重复取平均值。
1.4 数据统计分析
采用Microsoft Excel 2019进行数据整理，SPSS 27.0对数据进行方差分析，OriginPro 2021软件制图。
利用模糊数学隶属函数法[25]对不同贮藏年限下的白三叶种子质量进行综合评价，首先分别计算出各指标的隶属函数值，然后按照隶属函数值的平均值进行排名。
如果某个指标与种子质量正相关，计算公式如下：
如果某个指标与之负相关，则用反隶属函数进行计算，计算公式如下：
式中：U(Xi)为隶属函数值，Xi为某个指标的测定值，Xmax和Xmin为所有处理中某个指标的最大值和最小值。
2.1 贮藏年限对白三叶种子萌发的影响
贮藏1年的种子发芽率、发芽势、发芽指数和活力指数显著高于贮藏3～5年的种子(P<0.05)(图1)。其中，白三叶种子发芽率和发芽势随贮藏时间的增加呈先上升后下降的趋势，0～2年贮藏期内，白三叶种子发芽率和发芽势无显著差异，贮藏3年的种子发芽率和发芽势开始显著下降，到贮藏5年时，白三叶种子发芽率和发芽势均显著低于其他各贮藏年限(P<0.05)(图1A,图1B)。随贮藏年限增加，白三叶种子发芽指数和活力指数变化趋势一致，其中，贮藏1年的的种子发芽指数和活力指数显著高于其他贮藏年限(P<0.05)；
贮藏2～3年的种子发芽指数和活力指数显著高于贮藏4～5年的种子(P<0.05)，贮藏4年的种子发芽指数和活力指数显著高于贮藏5年的(P<0.05)，贮藏5年的种子发芽指数和活力指数显著低于其他各贮藏年限(P<0.05)(图1B,图1C)。
图1 不同贮藏年限白三叶种子萌发指标的变化
2.2 贮藏年限对白三叶幼苗生长的影响
随贮藏年限的增加，白三叶幼苗芽长、根长及鲜重呈先上升后下降的趋势，且各指标均在贮藏1年表现最佳(表1)。其中1～5年贮藏期内，白三叶幼苗芽长和根长逐渐下降，表现为各贮藏年限间差异显著(P<0.05)。白三叶幼苗鲜重在贮藏1年时达到最大值为0.56 g，显著高于其他各贮藏年限(P<0.05)；
贮藏2年的白三叶幼苗鲜重显著高于贮藏4，5年的(P<0.05)；
贮藏4年的白三叶幼苗鲜重显著高于贮藏5年的(P<0.05)；
贮藏5年的白三叶幼苗鲜重显著低于其他各贮藏年限(P<0.05)。
表1 贮藏年限对白三叶幼苗生长的影响
2.3 贮藏年限对白三叶种子相对电导率及抗氧化酶活性的影响
白三叶种子相对电导率随贮藏年限的增加呈上升趋势，其中，贮藏0年的种子相对电导率最低，为6.69%，显著低于贮藏2～5年的种子(P<0.05)，贮藏2～3年的种子相对电导率显著低于贮藏4～5年的(P<0.05)，贮藏4年的种子相对电导率显著低于贮藏5年的(P<0.05)(图2A)。白三叶种子POD活性在0～4年贮藏期内无显著差异，平均值为7.02 U·g-1；
贮藏5年的种子POD活性显著低于贮藏0，1年的(P<0.05)，仅为5.40 U·g-1(图2B)。随贮藏时间的增加，白三叶种子SOD和CAT活性逐渐下降，其中，0～2年贮藏期内，SOD和CAT活性无显著差异；
贮藏4年后，其活性开始显著下降，到贮藏5年时，SOD和CAT活性显著低于其他各贮藏年限(P<0.05)(图2C,图2D)。
图2 不同贮藏年限白三叶种子相对电导率及抗氧化酶活性的变化
2.4 贮藏年限对白三叶种子呼吸关键酶活性的影响
随贮藏年限的增加，白三叶种子COX，MDH，ICDH活性呈下降趋势(图3)。其中，贮藏0年的种子COX，MDH，ICDH活性显著高于贮藏2～5年的(P<0.05)，贮藏1年的种子COX，MDH，ICDH活性显著高于贮藏4～5年的(P<0.05)，贮藏2～3年的种子COX，MDH，ICDH活性无显著差异，贮藏5年的种子COX，MDH，ICDH活性显著低于其他各贮藏年限(P<0.05)(图3A,图3B,图3C)。白三叶种子APA活性随贮藏年限的增加呈先上升后下降的趋势，在贮藏1年时达到最大值，之后逐渐下降，其中1～5年贮藏期内，白三叶种子APA活性表现为各贮藏年限差异显著(P<0.05)(图3D)。
图3 不同贮藏年限白三叶种子呼吸关键酶活性的变化
2.5 综合分析
本试验采用隶属函数法，以发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数、芽长等15项指标作为评价指标，综合评价不同贮藏年限白三叶种子的质量。贮藏6年下白三叶种子的平均隶属函数值在0.00～0.96(表2)。根据平均隶属函数值进行排序，得出贮藏6年下的白三叶种子质量由高到低依次为：贮藏1年>贮藏0年>贮藏2年>贮藏3年>贮藏4年>贮藏5年。
表2 不同贮藏年限下白三叶种子各指标隶属函数值及综合评价
3.1 贮藏年限对白三叶种子萌发的影响
种子老化是贮藏过程中影响种子质量和活力的主要原因之一，在种子贮藏过程中，保持较高水平的种子质量和活力至关重要[12]。发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数代表种子活力的高低，同时也是衡量种子质量的重要指标[26]。随着贮藏时间的延长，种子逐渐老化，表现为种子发芽率、发芽势等相关萌发指标逐渐下降[27-28]。本试验结果显示，白三叶种子贮藏0～2年发芽率和发芽势无显著差异，白三叶种子贮藏1～5年发芽率、发芽势、发芽指数和活力指数随贮藏时间的延长呈下降趋势。这表明白三叶种子在自然环境和自身生理生化指标等因素的共同作用下，老化程度加深，种子活力逐渐降低，这与许美玲等[29]研究结果一致。
3.2 贮藏年限对白三叶幼苗生长的影响
植物的生长指标可以较直观地表现出其受影响程度。贮藏多年的种子在室内做发芽试验时可以萌发，而在田间条件下很难出苗，或出苗不正常，这类种子虽然有生命力，但其活力较低，逆境条件下不能成为正常苗，在农业生产上失去了种用价值[30]。本研究以贮藏0～5年的白三叶种子为试验材料，研究结果表明贮藏年限对白三叶幼苗的生长产生抑制作用，其原因可能与因贮藏年限增加导致种子活力下降有关，这与张熙颖[31]的研究结论基本一致。辛慧慧等[32]也发现了贮藏年限的延长会降低紫羊茅和苇状羊茅幼苗长度和胚根长度，进一步证明了贮藏年限越长，幼苗长势越弱。
3.3 贮藏年限对白三叶种子相对电导率及抗氧化酶活性的影响
长期贮存会使种子老化，使细胞膜的完整性降低，酶促抗氧化系统遭受损伤，从而引起膜脂过氧化，加剧种子劣变程度，造成种子活力下降[33]。种子浸提液的相对电导率可反映种子内溶性物质的渗透程度，而渗透程度又可间接地反映出细胞膜的完整性[34]。SOD，POD和CAT共同构成了酶促抗氧化系统，SOD能将超氧阴离子歧化并将其转化为过氧化氢和氧气，有效减少活性氧的危害，从而建立起植物的抗氧化屏障。然后，在POD的协助下，CAT将过氧化氢分解为氧气和水，从而将活性氧的伤害降到最低[35]。本研究结果表明，随贮藏年限的增加，白三叶种子的相对电导率逐渐升高，SOD，POD和CAT活性逐渐下降，即白三叶种子老化后，种子内部可溶性物质的渗出量不断增加，使其细胞膜的完整性降低，从而破坏了酶促抗氧化系统，引发细胞膜脂过氧化，加剧种子退化，进而影响种子的活力，这与前人研究结果一致[36]。
3.4 贮藏年限对白三叶种子呼吸关键酶活性的影响
呼吸是所有生活细胞共同存在的一种生物行为，是植物新陈代谢过程中必不可少的一部分，为所有生物的生命活动提供了必要的的能量，对植物有着十分重要的意义[1]。在贮藏期间，种子的呼吸功能会逐步减弱，发芽率也相应地降低，并且在萌发能力完全丧失之前，表现出一种较为复杂的呼吸模式[12]。已有研究表明，经老化处理的种子，与呼吸有关的信号酶COX、MDH活性降低，线粒体的电子传递链还原性提高、呼吸控制比降低，氧化磷酸化进程受到抑制，使ATP合成基质供应减少，从而导降低种子的活力，最终失去萌发能力[37-39]。本研究结果显示，COX,ACP,IDH,MDH活性整体上随贮藏年限的增加而降低，即种子呼吸作用逐渐减弱，导致种子活力下降，与Xin等[37]研究结果一致。
白三叶种子的萌发指标和幼苗生长指标随贮藏年限的增加呈先上升后下降的趋势，均在贮藏1年时达到最大值；
随贮藏年限的增加，种子相对电导率逐渐上升，抗氧化酶和呼吸关键酶活性逐渐下降。采用隶属函数法对不同贮藏年限下的种子进行综合评价，得出贮藏0或1年的白三叶种子种用价值较高，最适合农业实际生产使用。