杨剑波， 曹倪豪， 程飞， 梁增亮， 杨菲
(南通市海门区人民医院泌尿外科，江苏省南通市 226100)
膀胱癌是泌尿系统常见的恶性肿瘤之一，常采用经尿道膀胱肿瘤切除术治疗。化疗在膀胱癌的治疗中发挥重要作用，但化疗产生的不良反应较大并可产生化疗耐药性，因而寻找安全有效的抗膀胱癌药物具有重要意义。研究表明，部分中医药可起到抑制膀胱癌的作用，然而尚未明确其作用机制[1-3]。土贝母苷甲是土贝母的主要活性成分，可通过诱导细胞凋亡而发挥抗肿瘤作用，通过调控miR-21表达而抑制胶质瘤细胞增殖及促进细胞凋亡[4]。miRNA可通过靶向调节靶mRNA而调控细胞增殖及凋亡等生物学行为。研究表明，miR-215-5p在前列腺癌中表达下调，上调其表达可抑制前列腺癌细胞转移[5]，但miR-215-5p是否可作为土贝母苷甲治疗膀胱癌的潜在靶点尚未可知。本研究探讨土贝母苷甲在膀胱癌中的抗癌作用，并通过miR-215-5p探讨其可能机制。
1.1 试剂
土贝母苷甲(上海一研生物公司)；
人膀胱癌细胞T24(南京科佰生物公司)；
DMEM培养液、胎牛血清(美国Gibco公司)；
Matrigel基质胶、LipofectamineTM3000 Transfection Reagent、Transwell小室、CCK-8试剂(北京索莱宝公司)；
RNA反转录试剂与荧光定量PCR试剂(北京天根生化公司)；
miR-215-5p mimics、anti-miR-215-5p、miR-NC、anti-miR-NC(广州锐博生物公司)；
兔抗人基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinases-2，MMP-2)、MMP-9抗体、二抗(美国Santa Cruz公司)；
RNA提取试剂(北京全式金生物公司)。
1.2 细胞培养和分组
于96孔板(100 μL/孔)接种对数生长期T24细胞，分别加入不同质量浓度(10、20、30 mg/L)土贝母苷甲培养基处理24 h[6]，分别记为低剂量组、中剂量组、高剂量组；
同时将正常培养的T24细胞记为对照组；
将miR-NC、miR-215-5p mimics分别转染至T24细胞，分别记为miR-NC组、miR-215-5p组；
将anti-miR-NC、anti-miR-215-5p分别转染至T24细胞，转染成功后加入30 mg/L土贝母苷甲培养基处理24 h，分别记为土贝母苷甲30 mg/L+anti-miR-NC组、土贝母苷甲30 mg/L+anti-miR-215-5p组。
1.3 CCK-8实验检测细胞增殖
各组T24细胞以100 μL/孔接种于96孔板，加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃恒温箱孵育2 h。酶标仪检测450 nm处光密度(OD)值并计算细胞存活率。
1.4 平板克隆形成实验
各组T24细胞以500个/孔接种于6孔板，37 ℃恒温箱培养14天，当出现细胞集落时弃培养基，加入4%多聚甲醛进行细胞固定20 min，并以1%结晶紫染色处理20 min，采用PBS洗涤后将其晾干，最后进行细胞计数。
1.5 Transwell实验检测细胞迁移与侵袭
迁移检测：采取无血清培养基处理各组T24细胞，获得单细胞悬液(细胞浓度1×105个/mL)，上室接种控制为100 μL/孔，并在下室放入600 μL完全培养基，连续培养24 h,加入多聚甲醛予以细胞固定20 min，然后结晶紫连续染色20 min，进行漂洗晾干，记录显微镜计数结果。侵袭检测：混匀培养基以及Matrigel基质胶，二者比例为1∶6，并将40 μL稀释液放入上室，37 ℃恒温箱凝固处理4 h备用,其他步骤同迁移测定。
1.6 qRT-PCR检测细胞miR-215-5p水平
用RNA提取试剂提取各组T24细胞总RNA，按照试剂盒说明书进行反转录及完成qRT-PCR过程。2-ΔΔCt法计算miR-215-5p相对表达量(U6为内参)。
1.7 Western blotting检测MMP-2、MMP-9蛋白
用二喹啉甲酸法测定蛋白水平，缓冲液加入50 μg蛋白，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，转移至PVDF膜。5%脱脂奶粉封闭PVDF膜2 h，用MMP-2(1∶1 000)、内参GAPDH(1∶2 000)、MMP-9(1∶1 000)一抗稀释液4 ℃孵育过夜，再用二抗稀释液(1∶5 000)室温孵育1 h。Image J软件获得蛋白相对灰度值。
1.8 统计学分析
2.1 土贝母苷甲对T24细胞增殖及克隆形成的影响
与对照组比较，低、中、高剂量组细胞存活率降低(P<0.05)，克隆形成数减少，且呈剂量依赖性递减(P<0.05；
图1)。
图1 土贝母苷甲对T24细胞增殖及克隆形成的影响
2.2 土贝母苷甲对T24细胞迁移、侵袭的影响
低、中、高剂量组迁移及侵袭细胞数均低于对照组(P<0.05；
图2)。
图2 土贝母苷甲对T24细胞迁移及侵袭的影响
2.3 土贝母苷甲对T24细胞miR-215-5p表达、MMP-2和MMP-9蛋白水平的影响
与对照组比较，低、中、高剂量组miR-215-5p表达升高，MMP-2、MMP-9蛋白水平降低，且均呈剂量依赖性(P<0.05；
图3)。
图3 土贝母苷甲对T24细胞miR-215-5p表达、MMP-2和MMP-9蛋白水平的影响
2.4 miR-215-5p过表达对T24细胞增殖、克隆形成、迁移及侵袭的影响
miR-215-5p组细胞存活率以及MMP-2、MMP-9蛋白水平低于miR-NC组(P<0.05)，细胞克隆形成数、迁移及侵袭细胞数也均低于miR-NC组(P<0.05；
图4)。
图4 miR-215-5p过表达对T24细胞增殖、克隆形成、迁移及侵袭的影响
2.5 抑制miR-215-5p表达可逆转土贝母苷甲对T24细胞增殖、克隆形成、迁移及侵袭的作用
土贝母苷甲30 mg/L+anti-miR-215-5p组细胞存活率、克隆形成数、迁移及侵袭细胞数以及MMP-2、MMP-9蛋白水平均高于土贝母苷甲30 mg/L+anti-miR-NC组(P<0.05；
图5)。
图5 抑制miR-215-5p表达可逆转土贝母苷甲对T24细胞增殖、克隆形成、迁移及侵袭的影响
膀胱癌细胞转移是导致患者复发率高及预后不良的重要原因，手术结合放化疗是膀胱癌的主要治疗手段，但具有较大的不良反应，目前中药提取物成为治疗膀胱癌的研究重点[7]。miRNA可结合3′UTR的目标信使RNA(mRNA)并影响其转录过程，还可能作为膀胱癌治疗的潜在靶点[8-9]。但中药提取物是否以miRNA为靶点而发挥抗膀胱癌作用尚需进一步探究。
土贝母苷可抑制非小细胞肺癌[10]、胶质母细胞瘤[11]、前列腺癌[12]细胞增殖和转移。本研究结果显示，土贝母苷甲具有降低T24细胞存活率以及减少其克隆形成功效，且呈质量浓度依赖性，证实土贝母苷甲能够对膀胱癌细胞增殖过程与克隆形成产生抑制作用。MMP-2、MMP-9可通过降解细胞外基质而增强细胞转移[13]。本研究结果显示，对于癌细胞迁移与侵袭、MMP-2及MMP-9能够产生明显抑制作用，呈现药物剂量依耐性降低趋势，证实土贝母苷甲能够对T24细胞的侵袭与迁移行为具有抑制作用。
miR-215-5p可通过靶向Sox9而抑制乳腺癌细胞侵袭[14]。miR-215-5p低表达量与结直肠癌患者临床分期、不良预后有关[15]。miR-215-5p可抑制结直肠癌细胞增殖及转移[16]。miR-215-5p可抑制间皮瘤进展[17]。本研究结果显示，随着土贝母苷甲质量浓度的不断升高，膀胱癌细胞中miR-215-5p的表达量逐渐升高，抑制miR-215-5p表达可降低土贝母苷甲对膀胱癌细胞恶性行为的抑制作用；
提示土贝母苷甲通过调控miR-215-5p表达而调节膀胱癌细胞增殖、迁移及侵袭。
综上所述，土贝母苷甲可抑制膀胱癌细胞的增殖、迁移和侵袭行为，其作用机制与促进miR-215-5p的表达有关。但关于其具体作用机制仍需进一步探究。
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