李惠静 李忠琴 庄若飞 林章秀 罗 琳 李 莉
（1.厦门惠盈动物药业有限公司 福建厦门 361023；
2.鳗鲡现代产业技术教育部工程研究中心 福建厦门 361021；
3.集美大学水产学院 福建厦门 361021）
我国鳗鲡养殖已有多年历史，是世界上最大的鳗鲡生产国[1]。鳗鲡的常见疾病以细菌性疾病危害最为严重。据报道，鳗鲡细菌性疾病的病原主要以气单胞菌、假单胞菌、鳗弧菌、爱德华氏菌及柱状屈桡杆菌为主[2-6]。针对鳗鲡细菌性疾病的治疗，目前多数采用化学制剂类和抗生素类药物[4-7]。氟苯尼考，又叫氟甲砜霉素，其结构中磺酰甲基取代氯霉素的-NO2基团，避免了潜在的骨髓抑制或再生障碍性贫血等危害，可用于防治鳗弧菌 （Vibrio anguillarum）、迟缓爱德华菌（Edwardsiella tarda）等引起的疾病[8]。《中华人民共和国兽药典》（2020年版）指出，可以用于水产动物的氟苯尼考制剂有氟苯尼考粉和氟苯尼考注射液[9]，但由于氟苯尼考水溶性差，生物利用度低，限制了其在制剂和临床上的应用。
鳗业是典型的出口依赖型外向型行业，鳗鲡产品中的抗生素药物残留问题导致的食品质量安全问题，严重影响我国鳗鲡出口贸易及其养殖业的健康发展[10-11]。众多研究[12-17]均是考察氟苯尼考原料药在鳗鲡体内的代谢规律，对氟苯尼考制剂的代谢研究相对较少，不同剂型应用于鳗鲡时，其体内消除呈现不同的规律。因此本文以氟苯尼考粉、氟苯尼考溶液为试验药品，采用连续多次口灌日本鳗鲡，检测其在鳗鲡体内各组织（血浆、肝脏、肾脏、肌肉）的含量，解析氟苯尼考在日本鳗鲡各组织内的消除规律，为不同需求提出休药期建议，为鳗鲡养殖中合理使用氟苯尼考粉剂和液体制剂提供科学参考。
1.1 材料 试验药品：氟苯尼考标准品（来源中国兽医药品监察所）；
氟苯尼考粉、氟苯尼考溶液（含量以10%氟苯尼考计，来源厦门惠盈动物药业有限公司）；
肝素钠、乙腈（HPLC）、冰醋酸（HPLC）、乙酸乙酯、正己烷等均为市售分析纯。
试验动物：日本鳗鲡 （369±58 g），饲养在70 cm×40 cm×40 cm水箱中，水温控制在25℃左右，暂养10 d后进行抽样，检测其体内无氟苯尼考残留[12]。
1.2 方法
1.2.1 给药方法与样品采集处理[12]将暂养的日本鳗鲡随机分为两组，每组15尾日本鳗鲡，称取氟苯尼考粉、氟苯尼考溶液适量，加入不含淀粉的鳗鱼饲料，加水配制成含氟苯尼考10 mg/mL的糊状液，采用多次给药，连续5 d，每天1次，按30 mg/kg剂量口灌给药，将鳗鲡放进水中进行观察。期间鳗鲡无回吐现象才继续进行试验。
鳗 鲡 分 别 于 给 药 后 第1 d、2 d、3 d、5 d、8 d、12 d、20 d、30 d进行血液、肝脏、肾脏、肌肉等样品采集，每个时间点采集5尾，采集的血液样品在0.1 g/L肝素钠润洗风干的离心管中，5 000 r/min离心15 min，将上层血浆提取出来置-80℃保存。采集血液后，放血完成，取出肝脏、肾脏和背鳍附近的轴肌，-80℃密封保存。
1.2.2 样品前处理 血样处理：取1 mL血浆样品置于10 mL离心管中，加入2 mL纯乙酸乙酯，漩涡振荡5 min，10 000 r/min离心10 min，取其上清液于相同规格PVC管中。重复该步骤2次，合并上清液。将提取好药物的PVC管放入氮吹仪，60℃用氮气流挥干，挥干后加入流动相1 mL，涡旋振荡5 min，超声波溶解残留物，直至溶解完全。加入正己烷1.5 mL，涡旋振荡均匀后离心10 min使其分层，弃去上清液，重复加入正己烷1次，通过孔径为0.22 μm的滤膜过滤，储存于进样瓶中，放置4℃冰箱备用[8]。
组织样品处理：肌肉、肝、肾等样品解冻后剪碎，放入组织匀浆机打散成泥状，称取1 g置于10 mL离心管中，方法同血样处理。
1.2.3 色谱条件 色谱柱型号为C18（4.0 mm×250 mm，5 μm），柱 温35℃；
紫 外 检 测 波 长 为223 nm；
流动相乙腈:水:冰醋酸（200:797:3），流速1 mL/min；
进样量10 μL。
1.2.4 标准储备液的配制 精密称定氟苯尼考标准品，加流动相溶解并定量稀释，制成200 μg/mL氟苯尼考标准储备溶液。
1.2.5 标准品标准曲线绘制 准确移取氟苯尼考标准 储 备 液，依 次 稀 释 成100、50、10、5、1、0.5、0.1、0.05 μg/mL标准工作液，过0.22 μm有机相滤头后通过HPLC进行测定，以峰面积为纵坐标，标准工作液质量浓度为横坐标绘制标准曲线，分别求出回归方程和相关系数。
1.2.6 样品标准曲线绘制 使用加入法，在各组织的离心管中分别加入一定量的氟苯尼考标准储备液，使其成为质量浓度分别为100、50、10、5、1、0.5、0.1、0.05 μg/mL样品标准工作液，过0.22 μm有机相滤头后通过HPLC进行测定，以峰面积为纵坐标，样品标准工作液质量浓度为横坐标绘制标准曲线，分别求出回归方程和相关系数。
1.2.7 回收率和精密度测定 每种组织（血浆、肝脏、肾脏、肌肉）取空白组织，制成含0.1、1.0、10.0 μg/mL（以氟苯尼考计）的样品。按照1.2.2方法制样，HPLC检测，计算各组织中的回收率。对上述样品1 d内分5次进行测定，每个时间点的浓度重复测定3次，计算日内精密度；
连续测定5 d，每次重复测定3次，计算日间精密度。
1.3 休药期计算 利用SPSS20.0软件对药时数据以一级消除动力学方程C1=C0e-ket进行拟合，获得消除曲线的纵截距C0和消除速率常数Ke，消除半衰期t1/2=0.693/ke，休药期（WDT）=ln（C0/MRL）/Ke，以氟苯尼考MRL为0.2 μg/g计算[12]。
1.4 数据处理 利用Excel和SPSS20.0软件对试验数据进行处理。
2.1 氟苯尼考的色谱分离及最低检测限 利用液相色谱分析血浆空白样品、氟苯尼考标准品、添加氟苯尼考的血浆，通过色谱图（见图1）可以清晰观察到，氟苯尼考的特征峰峰型尖锐，保留时间为12.06 min，与其他杂峰能够很好地分离。以三倍信噪比 （S/N）计算，氟苯尼考的最低检测限为0.02 μg/mL；
其余组织（肾脏、肝脏、肌肉）均与血浆中氟苯尼考色谱图相似，特征峰谱峰尖锐，分离效果明显。
图1 血浆中氟苯尼考色谱图
2.2 标准工作曲线、样品标准曲线绘制 以标准工作液质量浓度为横坐标x，峰面积为纵坐标y，绘制标准曲线（见图2）。结果表明，在0.05～100 μg/mL范围线性良好，线性回归方程为：y=2.939x-0.112，相关指数（R2）为0.9999。
图2 氟苯尼考标准工作曲线
血浆中氟苯尼考标准曲线线性回归方程为：y1=2.8486x1-0.2279，R2=0.9991（见图3）；
肾脏中氟苯尼考标准曲线线性回归方程为：y2=2.5125x2-1.6868，R2=0.9975（见图4）；
肝脏中氟苯尼考标准曲线线性回归方程为：y3=3.0808x3-0.5116，R2=0.9990（见图5）；
肌肉中氟苯尼考标准曲线线性回归方程为：y4=2.9238x4-0.2117，R2=0.9997（见图6）。
图3 血浆样品工作液标准曲线
图4 肾脏样品工作液标准曲线
图5 肝脏样品工作液标准曲线
图6 肌肉样品工作液标准曲线
2.3 回收率和精密度 本试验条件下，添加0.1、1.0、10 μg/mL氟苯尼考[13]在血浆中的回收率为98.69%～102.31%、肝脏中的回收率为89.37%～96.37%、肾脏中的回收率为88.64%～95.22%、肌肉中的回收率为83.45%～89.54%，日内精密度为0.40%～5.13%，日间精密度为0.36～5.27%（见表1），说明该试验方法重现性好，精密度高。
表1 氟苯尼考在不同组织中的回收率和精密度
2.4 氟苯尼考粉和氟苯尼考溶液在日本鳗鲡体内的残留量 氟苯尼考粉和氟苯尼考溶液在日本鳗鲡4种组织中不同采样时间的残留浓度见表2-表3，日本鳗鲡经多次口灌氟苯尼考粉和氟苯尼考溶液后，体内药物的消除曲线见图7。可以看出，氟苯尼考在日本鳗鲡体内分布较广，血浆对氟苯尼考的消除是最快的，肾脏的消除是最慢的，肝脏和肌肉对氟苯尼考的消除差异不大；
日本鳗鲡应用氟苯尼考溶液消除代谢比氟苯尼考粉快；
氟苯尼考粉和氟苯尼考溶液在血浆中氟苯尼考第5 d残留量相对于第1 d的残留量分别降低30.7%和72.9%，在肝脏中第5 d残留量相对于第1 d的残留量分别降低66.9%和69.7%，在肾脏中第5 d残留量相对于第1 d的残留量分别降低55.6%和70.9%，在肌肉中第5 d残留量相对于第1 d的残留量分别降低57.4%和63.8%。可见，氟苯尼考溶液5 d内代谢消除比氟苯尼考粉代谢消除更快。
图7 氟苯尼考粉和溶液在日本鳗鲡体内不同组织的消除曲线
表2 氟苯尼考粉在日本鳗鲡4种组织中的残留浓度
表3 氟苯尼考溶液在日本鳗鲡4种组织中的残留浓度
2.5 氟苯尼考粉和氟苯尼考溶液在日本鳗鲡体内的消除规律 氟苯尼考粉和溶液在鳗鲡体内以一级动力学方式消除，其消除动力学参数及推算的休药期结果见表4。可以看出，氟苯尼考制成氟苯尼考粉和溶液后多次口灌日本鳗鲡，在其体内均能够进行有效消除，氟苯尼考溶液的消除速率比氟苯尼考粉稍快一点；
这两种剂型在鳗鲡的血浆、肝脏、肌肉等部位并没有较高的残留现象，肾脏的消除速率会稍慢些。
表4 氟苯尼考粉和氟苯尼考溶液在日本鳗鲡4种组织中的消除动力学参数、休药期
3.1 不同剂型氟苯尼考的代谢和残留Horsberg等[14]研究氟苯尼考在大西洋鲑体内的代谢和消除规律，以10 mg/（kg·d）剂量管饲，给药后56 d，皮肤、肝脏和肾脏仍然能检测到氟苯尼考残留，而在给药后28 d，血浆和肌肉中已经不能检测到氟苯尼考，肌肉中氟苯尼考的检出率从90%（6 h）缩减到20%（3 d）。郑重莺等[15]研究了氟苯尼考在南美白对虾体内的残留消除规律，在血液、肌肉等部位药物残留量比较少，给药后，氟苯尼考浓度均缓慢下降，10 d后血液中的氟苯尼考不能检出，但肌肉中20 d时仍有低量检出。陈星星[13]给欧洲鳗鲡按100 mg/kg单剂量口服氟苯尼考，给药后大部分约1 h达到峰值，分布迅速而广泛，吸收半衰期T1/2Ka为3.82±6.40 h。本试验采用多剂量给药，连续5 d，每天1次，按30 mg/kg剂量口灌给药，可以观察到口服氟苯尼考粉和氟苯尼考溶液后，日本鳗鲡吸收迅速，分布广泛，抗菌活性好，体内半衰期较长，残留小，临床上可推广使用。依据消除规律分析，氟苯尼考粉在日本鳗鲡血浆、肝脏、肾脏、肌肉中t1/2分别为8.9、6.4、11.2、5.7 d；
氟苯尼考溶液在日本鳗鲡血浆、肝脏、肾脏、肌肉中t1/2分别为8.3、6.9、7.5、8.2 d，在血浆和肝脏中无显著差别，在肾脏和肌肉中半衰期差别较大。林茂等[16]研究了氟苯尼考在两种鳗鲡体内的残留及消除规律，在25℃，以30 mg/kg剂量多次口灌给药后，氟苯尼考在鳗鲡体内以一级动力学方式消除，半衰期t1/2较长，在日本鳗鲡和欧洲鳗鲡血浆中半衰期分别为7.8 d和8.3 d，本研究也是采用在25℃，以30 mg/kg剂量多次口灌给药应用于日本鳗鲡，氟苯尼考粉和溶液在血浆中半衰期分别为8.9 d和8.3 d，氟苯尼考粉比氟苯尼考原药直接给药用于日本鳗鲡的半衰期要长，说明药物作用时间更长；
氟苯尼考溶液与氟苯尼考原药直接给药用于日本鳗鲡的半衰期相当，说明溶液剂型对日本鳗鲡的作用时间没有因为剂型改变而受到影响。
从本试验也可以看出，相同给药剂量的氟苯尼考粉和氟苯尼考溶液应用于日本鳗鲡时，溶液剂型的消除代谢比粉剂剂型更快；
不同水产种类、采用不同给药剂量、采用不同的软件推算、不同的组织部位有不同的消除规律。
3.2 不同剂型氟苯尼考的休药期 农业部第278号公告规定了氟苯尼考在所有鱼类中的休药期为375℃·d（相当于25℃水温下15 d），未考虑不同鱼种类对药物消除速度的影响。黄聚杰等[17]以60 mg/kg（氟苯尼考）的高剂量单次给药后，利用WT程序计算的结果显示，氟苯尼考在花鲈肌肉、肝、肾和血浆中的理论休药期分别为6.54、8.69、8.30和5.89 d。余培建等[10]用100 mg/kg浓度口灌给药后采用PKS软件对血浆、肌肉、肝脏、肾脏测得的药物浓度进行分析，拟合结果采用开放性二室模型描述，推算出欧洲鳗鲡对氟苯尼考休药期为11.6 d。林茂等[12]研究了在25℃下以30 mg/kg多次口灌给药后，血液残留较少，以肌肉为食用部位休药期大于23.2 d，以肾脏为食用部位休药期应大于38.7 d。陈星星[13]给欧洲鳗鲡按100 mg/kg单剂量口服氟苯尼考，血液、肌肉、肝脏代谢过程符合开放型一级吸收二室模型，通过WT1.4计算，休药期不少于6 d。林茂等[16]以30 mg/kg对两种鳗鲡口灌给药后用SPSS 11.0对血浆、肌肉、肝脏、肾脏测得的药物浓度进行分析，拟合结果采用一级消除动力学方程进行拟合，如规定最高残留量为0.2 μg/g，日本鳗鲡和欧洲鳗鲡最大休药期分别为38.7 d和28.5 d，若只以肌肉为食，最大休药期为23.2 d和28.0 d；
如规定最高残留量为1 μg/g，日本鳗鲡和欧洲鳗鲡最大休药期分别为19.0 d和11.2 d，若只以肌肉为食，最大休药期为5.2 d和4.3 d。据本试验研究结果，如只以肌肉为食，针对国内或欧美市场的日本鳗鲡使用氟苯尼考粉和氟苯尼考溶液的休药期所需时间分别为9.9 d和4.5 d；
如以整鳗食用，出口日本的日本鳗鲡使用氟苯尼考粉和氟苯尼考溶液休药期就至少需要分别延长至32.1 d和18.2 d。以日本鳗鲡为研究对象，林茂等[12]研究表明的休药期比本试验研究的均更长。因此，还需结合具体给药方案、具体食用部位和不同地区标准制订针对性的参考休药期，以指导氟苯尼考在鳗鲡养殖行业的合理用药。
本研究采用在25℃以30 mg/kg剂量多次口灌给药应用于日本鳗鲡，氟苯尼考粉和溶液在血浆中半衰期分别为8.9 d和8.3 d，氟苯尼考粉比氟苯尼考原药直接给药用于日本鳗鲡的半衰期要长，说明药物作用时间更长；
氟苯尼考溶液与氟苯尼考原药直接给药用于日本鳗鲡的半衰期相当，说明溶液剂型对日本鳗鲡的作用时间没有因为剂型改变而受到影响。如只以肌肉为食的日本鳗鲡使用氟苯尼考粉和氟苯尼考溶液，休药期所需时间分别为9.9 d和4.5 d；
如以整鳗食用的日本鳗鲡使用氟苯尼考粉和氟苯尼考溶液，休药期就至少需要分别延长至32.1 d和18.2 d。