彭能胜，邓思怡，常 威，刘 军*，陈富华
(1.来凤县农业技术推广中心，湖北 来凤 445700；
2.湖北省农业科学院植保土肥研究所/华中作物有害生物综合治理重点实验室，湖北 武汉 430064；
3.襄阳市樊城区牛首镇农业技术推广服务中心，湖北 襄阳 441100)
花菜别名花椰菜，是十字花科芸薹属的一年生或二年生的草本植物，是甘蓝的变种，十字花科最著名的蔬菜之一[1]。花菜叶大，花黄白色，球形，喜温和气候，耐寒力较弱，常在我国温暖地区种植[2]。因其味美、营养丰富且种植经济较低而广受消费者和农民的喜爱[3]。近年来，花菜的种植面积逐年增大，在湖北省天门、孝感、襄阳等地都有较大面积种植，规模位居全国前列，具有良好的社会、经济效益[4-6]。然而，在荆州市江陵县普济镇的种植中发现一种导致花菜花球腐烂的病害，病重年份发病率可达40%～60%，严重影响了花菜的商品性，给当地农户带来巨大损失。本研究对荆州市江陵县普济镇采集的花菜样品上的病原进行了分离培养，结合形态学和分子生物学等方法对病原进行了鉴定，根据柯赫氏法则测定其致病性，为花菜病害在生产上的防治提供理论依据。
1.1 试验材料
2021年12月24日由湖北省农业科学院经济作物研究所尹延旭博士送来的荆州市江陵县普济镇采集的感染病害的花菜植株，在实验室对引起花菜样品发病的病原菌进行分离培养。
1.2 试验仪器
PDA固体培养基(马铃薯(200 g)煮提液，葡萄糖20 g，琼脂粉15～20 g，水1 000 mL)；
光学显微镜；
植物基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)。
1.3 病原菌的分离[7]
1.3.1 病样组织块初步培养
采用组织分离法[8]对花菜病叶的病健交界处进行分离，用无菌手术刀切取0.5～1 cm大小的组织块，用15%双氧水清洗15 s，75%酒精清洗30 s，再用无菌水清洗三次，用灭菌滤纸吸干组织块表面的水分，病部朝上置于PDA培养基中。于室温下平放培养1 d，待表面生长出菌丝后再倒置培养2～3 d。
1.3.2 病样菌丝及菌丝团初步培养
灭菌牙签挑取不同部位的菌丝，接种到PDA培养基中。于室温下平放培养1 d，待表面生长出菌丝后再倒置培养2～3 d。
1.4 分离菌的纯化[7]
用灭菌牙签挑取疑似病原菌进行纯化培养。选取菌落外围的菌丝，接种于PDA培养基种。于室温下倒置培养3～5 d，置于4℃保存。
1.5 分子学鉴定[7]
按照植物基因组DNA提取试剂盒说明书提取病原菌DNA，进行PCR扩增。引物为ITS(ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’；
ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)。PCR反应条件：95℃预变性5 min；
94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸60 s，30个循环；
72℃再延伸5 min。反应结束后进行1%琼脂凝胶电泳检验。PCR产物送上海生工生物工程公司进行测序，测序结果在NCBI(National Center for Biotechnology Information)数据库中进行比对。
1.6 致病性测定
将菌株在PDA培养基上活化培养7 d，用直径5 mm的打孔器在菌落边缘打取菌丝块。把菌丝块接种于有伤口的离体花菜叶片上，接种无菌PDA培养基块作为对照，置于25℃恒温箱中。待叶片发病后再进行分离培养和鉴定。
2.1 发病症状鉴别
叶片感染病后，初呈水渍状，淡绿色，湿度大时长出少量白霉，病斑呈灰褐色，蔓延速度快，致叶片枯死；
花球发病，多始于花球表面凹陷处，初呈水渍状，淡绿色，湿度大时长出少量白霉，后形成菌核，严重时导致花球腐烂[9]。病样为成株期发病，在近地面的茎、叶片上出现淡褐色不规则的病斑，病组织软腐，病部表面长出白色至灰白色絮状菌丝体，与花菜菌核病危害症状一致(图1)。
图1 感病的花菜植株
2.2 菌落形态学鉴别
纯化的单菌落的菌丝为白色，培养期间PDA无变色现象。培养5 d后，白色菌丝平铺在培养基上(如图2左侧两个皿)；
培养10 d后，有明显黑色菌核(如图2右侧四个皿)。与核盘菌的菌落形态学一致。
图2 分离出的单菌落
2.3 病原菌分子学鉴别
ITS1/4引物对提取的病原菌DNA进行PCR扩增，扩增产物条带单一清晰，大小约500 bp，满足序列测序要求(图3)，扩增产物测序后在NCBI数据库进行BlastN序列分析，序列比对结果为核盘菌(Sclerotiniasclerotiorum)。
图3 引物ITS1/4对提取DNA的PCR产物扩增结果M：DL2000; 1-3：发病花菜样品DNA
2.4 致病性测定
菌株离体接种的致病性测定结果显示，接种菌丝块的叶片上的发病症状与田间一致；
对照的PDA培养基块接种没有出现病斑。对接种发病的花菜植株再次分离鉴定，均鉴定为核盘菌(Sclerotiniasclerotiorum)。
花菜菌核病是近年来威胁花菜花球和种子生产的一种流行病害，是花菜上最重要的病害之一。可以侵染花菜几乎所有的组织器官，发病严重时，发病率高达50～60%，严重影响花菜的品质和产量，限制了花菜生产以及制种业的发展[10-12]。本试验通过发病症状、菌落形态以及ITS序列分析，认为样品病害为花菜菌核病，其病原菌为核盘菌(Sclerotiniasclerotiorum)，为生产中的病害防治提供了理论依据，为之后病原的致病机理以及预防策略等方面的研究打下基础。
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