周 超 马银鹏 包旭翔 李春君 张介驰,2*
（1.黑龙江省科学院微生物研究所，黑龙江 哈尔滨 150000；
2.黑龙江省科学院高技术研究院，黑龙江 哈尔滨 150000）
黑木耳（Auricularia heimuer）又称光耳、云耳等[1]，隶属于担子菌纲、木耳目、木耳科、木耳属[2]。黑木耳食药兼用，具有高营养价值，含有蛋白质、脂肪、维生素等营养物质，以及多糖、黑色素、多酚、黄酮等活性物质[3]和人体必需的7 种氨基酸[4]。据中国食用菌协会统计，2020 年全国黑木耳产量再创新高，达到706.43 万吨，在食用菌产业中名列前茅[5]。
20 世纪40 年代二战期间，由于抗生素生产的需要，产生了液体深层发酵技术，美国弗吉尼亚大学Elmer.L.及Gaden.Jr 设计出了培养微生物的生物反应器。1948 年Humfeld[6]用液体发酵法成功培养出蘑菇菌丝体，此后，食用菌液体发酵技术得到进一步应用，并带动了多个食用菌品种的发酵技术研究。尤其对于部分无法人工栽培获得子实体的食用菌品种，液体深层发酵是大量获取菌丝体的重要方法，获得更多高品质的菌丝体已经成为发酵技术研究的主攻方向。然而，作为食用菌产业中的重要种类，黑木耳有关液体发酵技术的研究并不多，发酵技术强化研究主要聚焦于富集培养菌丝体和获得发酵活性物质。近年来，随着黑木耳菌包工厂化生产规模的扩大，黑木耳液体菌种需求量显著增加，推动了基于提升液体菌种生产能力和产品品质的研究工作。本文对黑木耳液体发酵的研究应用进展进行综述分析，以期为扩大黑木耳液体发酵产物应用领域和生产规模提供参考。
黑木耳可以通过人工栽培获得充足的子实体，因此其液体发酵研究和应用相较于其他无法人工栽培的食用菌品种并不活跃。但随着近年来黑木耳菌包工厂化生产规模的迅速扩大，液体菌种被大量使用，其液体发酵研究正在逐渐成为新的热点。为了得到更多高活力的菌丝体，黑木耳液体发酵研究主要关注于营养基质优化、发酵条件优化和外源物质影响方面，也有关于发酵活性产物的提取及液体饮品开发的研究。
1.1 营养基质优化研究
营养基质优化包括最佳原料筛选和基质配方优化。在原料筛选方面，以液体发酵产物中菌丝生物量为评价指标，开展了大量的单因素比较试验。如张恒银等[7]研究发现最适碳源和氮源分别为葡萄糖和酵母膏；
荆瑞勇等[8]研究发现最适碳源和氮源为蔗糖和豆粉；
矫天育[9]研究发现最适碳源是红糖，最适氮源是蛋白胨、酵母膏。也有研究表明最适碳氮源为一些农产品，如王庆武等[10]研究显示碳源以玉米粉、淀粉为佳，氮源以酵母膏、麸皮为佳；
王旭等[11]研究显示最适碳氮源为黄豆粉和麦麸。综上可见，当碳源为葡萄糖、蔗糖、红糖、黄豆粉、玉米粉等，氮源为酵母膏、麸皮、豆粉、蛋白胨时，黑木耳液体发酵菌丝生物量较高。虽然不同实验得出的最适碳氮源存在差异，但以上研究均认为有机碳氮源优于无机碳氮源。且上述实验配方中均有添加少量微量元素，可见微量元素也是不可或缺的。
在确定最适原料的基础上，有多项基质配方优化研究报道。李超等[12]和于海洋等[13]通过正交试验优化，分别得到最佳配方为葡萄糖2.00%、酵母膏1.00%、KH2PO40.30%、MgSO4·7H2O 0.15%和葡萄糖3.00%、酵母浸膏0.20%、MgSO4·7H2O 0.05%、KH2PO40.10%。钱雪婷等[14]和解修超等[15]则通过响应面法优化配方，分别得到最佳配方为葡萄糖2.16%、牛肉粉0.48%、KH2PO40.33 %、MgSO4·7H2O 0.10%和葡萄糖5.027%、蛋白胨0.45%、麦麸1.50%、MgSO4·7H2O 0.10%、KH2PO40.493%。综合分析以上基质优化配方，其碳氮源浓度基本一致，碳源浓度范围为2.00%～5.00%，氮源浓度范围为0.20%～1.00%。针对不同试验中最适碳氮源及浓度有所不同的情况，分析其原因可能与试验菌种特性有关，不同菌种的菌丝利用碳氮源速度不同，而原料的不同理化性质也会对发酵培养基性状造成影响。
1.2 发酵条件优化研究
液体发酵生产受环境条件影响较大，适宜的发酵条件能使黑木耳菌丝迅速生长而缩短生产周期。然而，发酵条件优化研究结果显示差异较大。孟丽君等[16]研究认为温度对菌丝生物量影响最大，其次为接种量、摇瓶转速、装液量。王谦等[17]报道初始pH 对菌丝生物量影响最大，其次为摇瓶转速、接种量，而温度对菌丝生物量影响则最小，该研究还发现当转速过高时会形成很大的剪切力，虽然提高了溶氧量，但菌丝体遭到破坏，影响了菌丝体的正常生长和代谢。众多研究结果显示，液体发酵最适温度在25～30 ℃之间，该温度范围与黑木耳菌丝固体培养一致。
此外，不同研究结果显示的最优装液量、摇瓶转速、培养时间和初始pH 均有差异，如李玉梅等[18]和钱雪婷[19]的研究结果表明，最佳装液量分别为65 mL 和100 mL（均为250 mL 锥形瓶），最适pH 分别为5.0 和5.85；
车星星等[20]和盛立柱等[21]的试验结果显示最佳培养时间分别为7 天和6 天。造成最优发酵条件差异较大的原因可能是由于试验菌株本身特性差异和培养基质特性差异。目前研究大都是利用摇瓶分批发酵，对规模化发酵罐通气培养的指导作用有限。张介驰等[22]利用20 L 发酵罐进行通气培养，跟踪发酵过程中多项指标的变化规律，并通过加大通气量、提高溶氧浓度的调控手段，有效抑制了发酵液中期pH 下降，该试验结果表明，在发酵过程中，针对发酵醪变化采取相关调控措施，可以提高液体发酵水平。
1.3 外源物质影响研究
除营养及发酵条件外，外源添加物质也会影响菌丝生物量，甚至在延缓液体菌种老化的问题上也有独特意义。根据张颖等[23]研究结果，刺五加水提液可明显提高黑木耳菌丝生物量，添加量在1%时菌丝生物量达到最大。潘琴等[24]报道不同浓度的麻栎木醋液对黑木耳菌丝生物量均起抑制作用，随着麻栎木醋液浓度的增加，菌丝生物量会出现不同程度的减少。说明不同外源添加物质会对菌丝生物量造成不同的影响。作为菌种使用的黑木耳液体发酵，不仅要菌丝生产效率高，同时也需要有较好的生物活性。许修宏等[25]研究不同营养物质对黑木耳液体菌种老化的影响发现，KH2PO4和维生素B1均能在延缓菌丝老化的同时促进菌丝生长，MgSO4能延缓菌丝老化但抑制菌丝生长，而过量蛋白胨会促进菌丝的老化及生长。该研究还发现，清除活性氧自由基相关酶的活性与菌丝老化具有显著相关性，酶活性的提高能延缓菌丝老化。液体菌种老化是困扰多年的问题，该实验结果为延缓菌种老化指明了新的研究方向。
1.4 获取特定发酵产物研究
除了用于生产液体菌种，获取特定的发酵产物也是开展黑木耳液体发酵研究的重要目的。黑木耳中含有多糖、黑色素、多肽、多酚、黄酮等多种活性物质，具有抗氧化性[26]、抗肿瘤[27]、抑菌抗病毒[28]、抗辐射[29]、提高免疫力[30]、改善肝损伤[31]、降血脂[32]等多种功效。从黑木耳子实体中提取活性物质是目前的主要途径，然而与之相比，从黑木耳液体发酵菌丝体及发酵液中提取活性物质具有自动化控制、规模化生产、成本低、速度快等优点。在这一方面，研究人员同样关注于对液体发酵技术进行营养、条件优化，但相比于制备液体菌种主要关注菌丝生物量及活力，液体发酵获取发酵产物则更注重于通过诱导或优化等手段提高黑色素、多糖等活性物质含量。
研究表明，活性物质的产量高低不仅与液体发酵时的营养条件有关，而且与所使用的菌株有关。李洋等[33]通过单因素及响应面实验优化得到黑木耳液体发酵产胞外多糖的最佳基质配方为：可溶性淀粉3%、胰蛋白胨0.15%、莎白瓜皮4%、红景天10%，此配方下胞外多糖含量为0.024 51 g/mL。范秀芝等[34]以菌丝生物量和多糖产量为指标从22 个国家审定黑木耳品种中筛选出黑木耳2 号（国家审定编号：2007018）高产多糖菌株，其多糖含量达到1.239 g/L，是其他菌株的2 倍以上。
大量研究表明，活性物质含量也受外源物质影响。如，Sun 等[35]研究发现酵母提取物、乳糖和酪氨酸对黑色素合成有显著影响，并首次证实酪氨酸能促进黑色素的合成。为提高黑色素浓度，该研究还对发酵培养基进行优化，与未优化的培养基相比，黑色素浓度提高了2.14 倍，达到2.97 g/L，同时还降低了成本。Wu 等[36]研究发现：1%甲醇、0.25%花生油、1.0%硬脂酸、0.5%棕榈酸均能促进黑色素的合成，而Tween 80 则显著抑制黑色素的合成。许哲祥等[37]发现刺五加、五味子两种中草药的添加量分别为4 g/L、3 g/L 时，能显著促进发酵液中多糖含量的提高。
综上所述，黑木耳液体发酵活性物质的产量受到营养物质、环境条件、菌株自身特性等多种因素的共同影响，关于哪种因素对某种活性物质产量的影响最大等问题，目前仍缺乏相应的研究。
1.5 黑木耳发酵饮料研究
黑木耳液体发酵能实现对硒、铁、锌、碘等微量元素进行富集，可以开发成富含微量元素的饮料、口服液、食品等，有利于人们在日常生活中摄入每天所必需的微量元素，避免因缺乏微量元素而导致的疾病，拥有健康的身体。目前黑木耳饮料多数仍由黑木耳子实体制备[38-41]，采用发酵液制作饮料虽起步较晚但也取得了一定的进展。使用液体发酵制作饮料时在添加营养源及外源物质时不仅要考虑菌丝及发酵液营养成分，更需要考虑发酵液的口感及安全性。
靳发彬等[42]将黑木耳液体发酵菌丝体经破壁匀浆处理后与苹果汁按照一定比例混合均匀，研究木耳果醋的发酵工艺参数和口味调配，结果发现酒精发酵的最适条件为温度30 ℃，酵母接种量0.02%，发酵时间5 天；
醋酸发酵的最适条件为温度35 ℃，接种量10%，起始pH 5.5。此条件下生产的发酵液，与苹果汁、蜂蜜调配后生产的成品黑木耳醋酸饮料同时具有醋酸饮料特有的风味和黑木耳的独特营养和药理作用。黄贤刚[43]以黑木耳发酵液和浓缩苹果汁为主要原料，通过正交实验和响应面试验对黑木耳液体深层发酵、酒精发酵、醋酸发酵的工艺进行了研究与优化，得到黑木耳苹果醋产品的最佳配方为黑木耳苹果醋10%、浓缩苹果汁40%、蔗糖10%。此配方下黑木耳苹果醋色泽金黄，澄清透明，清香醇郁，酸甜可口，口感柔和，同时具有醋香及果香。李颖跃等[44]通过正交试验优化配方开发黑木耳茶菌饮料，结果以配方红茶菌液25%、黑木耳发酵液40%、白砂糖8%、CMC（羧甲基纤维素）0.15%最佳，生产的该饮料色泽橘黄，风味独特，口感细腻，同时兼有黑木耳和红茶菌液的营养及保健价值。
除以上研究外，黑木耳发酵液也被应用于药物开发领域。其中，郝敏等[45]以黑木耳液体发酵液中的产物为材料进行研究的结果表明，黑木耳胞外多糖具有促进小鼠肠道有益菌群增殖、增加短链脂肪酸含量及上调血清抗炎因子水平的作用，对调节肠道微生态平衡和免疫反应有重要作用，具有替代抗生素的潜在价值。窦会娟等[46]通过实验证明黑木耳发酵液提取产物具有群体感应抑制作用，但不能抑制铜绿假单胞菌生物被膜的形成。目前虽然液体发酵制作饮料、药物等已经取得一定的研究进展，但仍有化妆品、膳食补充剂等较多领域等待探索。
黑木耳液体菌种研究报道最早在1983 年，万国昌等[47]对黑木耳、香菇等六种食用菌液体菌种进行初步探究，结果表明液体菌种具有周期短、成本低等优点，同时发现液体粘度与菌丝体数量成正相关，与菌丝体大小呈负相关。与固体菌种相比，液体菌种用于黑木耳栽培具有明显的优势。1989—2022 年期间，陈惠群[48]、刘永昶[49]、王玲[50]、叶晓菊[51]、冯伟林[52]等诸多科研工作者研究发现，黑木耳液体菌种接种后萌发快、生长点多，接种后的原种和栽培种培养周期缩短、基内菌丝菌龄一致性好、栽培出耳表现好。赵厚坤等[53]研究发现液体菌种接种的菌包满袋时间比固体菌种的缩短10～15 天，平均每袋产量提高10 g左右。据王庆武等[54]研究结果，黑木耳液体菌种比木屑和枝条菌种的制种周期分别缩短34 天和31 天，满袋时间分别缩短18 天和15 天。使用黑木耳液体菌种有利于缩短生产周期和提高生产效率，从而实现黑木耳菌包工厂化、规模化生产。
黑木耳液体发酵技术主要应用于黑木耳菌包生产企业的液体菌种生产。据黑龙江省食用菌协同创新推广体系统计，2021 年在黑木耳主产区黑龙江省，日产万袋以上的规模化黑木耳菌包生产企业超过300家，其中22 家日生产能力超过10 万袋的企业都在使用黑木耳液体菌种，大部分新建小型菌包生产企业也在使用液体菌种。黑木耳液体菌种生产一般采用800～1 000 L 通气发酵罐，绝大部分行分批发酵、极少使用连续发酵。其他黑木耳产区的大型菌包生产企业也在使用黑木耳液体种，生产应用日趋稳定成熟。据此估计，全国全年黑木耳液体菌种生产量可达60 000 m3，应用生产黑木耳菌包约30 亿袋。
由于我国黑木耳产量大、分布广，不同产地、季节和栽培模式生产的黑木耳产品质量参差不齐，部分黑木耳子实体被用来提取多糖、蛋白等功效物质，或者粉碎后制备颗粒饮料和冲剂，这在一定程度上限制了黑木耳液体发酵醪液中菌丝体和代谢产物应用于产品。目前，很多黑木耳液体发酵生产制备菌丝体、提取代谢产物和综合利用发酵醪液的技术成果还停留在中试水平，少见大规模生产应用。
液体发酵技术发展距今虽不到百年历史，但随着社会与科技的快速发展进步，液体发酵技术得以飞速发展和日趋完善，逐渐应用于多个领域。随着食用菌产业整体的提升，黑木耳也受到较大关注，关于黑木耳液体发酵的研究也逐渐深入宽泛，取得了较多突破性的进展，但也存在生产应用中迫切需要解决的问题。黑木耳液体发酵制备液体菌种的研究目前大多数以摇瓶实验为主，基于发酵罐生物反应器的研究偏少，还鲜见对通气条件下的深层发酵开展深入研究，导致在生产规模放大时出现较大偏差。摇瓶试验结果在影响倾向上可以提供有益借鉴，但还需要开展通气发酵条件的优化和实践应用检验。与此同时，黑木耳液体发酵醪液作为菌种应用的活性质量等评价指标还不够完善和准确，需要强化其与接种应用后实际生产效果的有效关联，并在此基础上建立实用的评价体系和简便的检测方法。
与固体基质栽培生产黑木耳子实体相比，液体发酵黑木耳在特定领域具有明显的优势。随着工业化信息化进程加速，黑木耳液体发酵的生产能力、生产效率和生产可控性必将逐步增强，在营养物质和功效物质生产提取方面具有巨大的潜在生产能力和发展空间。因此，有必要加强固体栽培和液体发酵生产黑木耳产品之间差异特性的比较研究，探索差异形成的生理机制，为更好地规模化应用黑木耳液体发酵技术奠定理论基础。
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