龚莉焰，李双阳，白雪
1.西南医科大学 中西医结合学院（泸州646000）；
2.西南医科大学附属中医医院神经内科（泸州 646000）
帕金森病（parkinson"s disease，PD）是一种好发于50 岁以上的中老年人、以运动障碍为主要表现的神经系统退变性疾病。PD 的发病机制主要认为与线粒体功能障碍、氧化应激、毒性蛋白质聚集等反应引起黑质、纹状体等部位的多巴胺能神经元变性死亡有关[1]。抗帕金森病首选药物治疗，作为金标准的左旋多巴是最有效的对症治疗药物[2-3]，但长期用药后大部分病人会出现症状波动及异动症为主的运动并发症[4]，未来我国PD 患病人数将占到全球PD 患病人数的一半[2]。因此，有效防治帕金森病，减少并发症至关重要。
《本草求真》言：“桑寄生，号为补肾补血要剂”，其味苦、甘，平，归肝、肾经，有补肝肾，强筋骨等功用[5]，以桑寄生为主的方剂常用于改善帕金森病引起的睡眠障碍、肢体震颤、腰膝酸软等症状。滋肾平颤汤（桑寄生、莪术、白芍等）联合左旋多巴组较单纯使用左旋多巴组不仅更有效地改善了帕金森病病人的动作迟缓、颤振等运动症状，提高病人日常生活能力与运动功能，而且在缓解睡眠障碍等非运动症状的同时并未增加不良反应[6-7]。杨戈等[8]也通过对MPTP诱导的PD模型小鼠的行为学观察，发现加味天麻钩藤饮组可改善PD模型小鼠的运动迟缓、步态异常及少动症状。此外，桑寄生中主要成分也被证实在抗PD 方面发挥了重要作用。槲皮苷[9]可显著改善神经毒性物质所致的神经损伤，江苪等[10]发现槲皮苷可以通过抑制细胞凋亡线粒体途径中相关蛋白Cytc和caspase-3的表达以保护H2O2诱导的PC12 细胞损伤，刘菡等[11]通过实验证明槲皮苷可通过激活PI3K/Akt/FoxO3a 信号通路，显著降低6-OHDA 处理后PC12 细胞中Caspase-3 和Bcl-2 的表达、升高Bax的表达，提高神经细胞活性、降低细胞凋亡水平，从而发挥抗PD作用。槲皮素可从多条途径在PD等神经系统退行性疾病中发挥神经保护作用，如抗氧化应激、保护线粒体、抑制谷氨酸的兴奋性神经毒性作用等[12]。齐墩果酸[13]也能发挥抗抑郁、抗神经毒性、改善学习记忆等多方面改善PD运动和（或）抑郁、认知障碍等非运动症状[14]。由此可见，桑寄生在PD的治疗中发挥了重要作用，但由于中药具有“多成分、多靶点、多通路”的特点，具体的作用机制尚不明确。本研究基于网络药理学方法，对桑寄生治疗PD 的主要活性成分、重要靶点及相关生物学过程和信号通路进行有效预测和推断，为后续研究PD治疗提供新的思路。
1.1 桑寄生主要活性成分和靶点的收集、转换
通过中药系统药理学数据库和分析平台（Tradi⁃tional Chinese Medicine Systems Pharmacology，TCMSP），以口服生物利用度（oral bioavail ability，OB）≥30%和类药性（drug-likeness，DL）≥0.18 作为筛选条件，筛选桑寄生主要活性成分。同时根据相关文献检索查找桑寄生治疗帕金森病可能活性成分[15-16]，并利用Swiss ADME 进行筛查（筛查条件：GI absorption：HIGH，drug⁃likeness 中至少2 个YES）。汇总所有活性成分，通过SwissTargetPrediction（http://www.swisstarget-prediction.ch/）数据库进行靶点预测（筛选标准：同时满足3D相似性阈值设置为0.75、2D相似性阈值设置为0.45及Prob⁃ability>0），并利用UniProt 数据库（https://www.uniprot.org/）进行基因转换。
1.2 帕金森病靶点获取
以“Parkinson Disease”或“Parkinson"s disease”为关键词在Disgenet 数据库（https://www.disgenet.org/）中检索帕金森病相关靶点，将所得疾病靶点汇总去重（注：disgenet 数据库中Score_gda 的值越高，代表该靶点与PD 联系越密切，本研究筛选标准为Score_gda ≥0.2；
genecards数据库中按照revwlance score由大至小排列，选取前120条）。
1.3 “活性成分－关键靶点”网络构建与分析
应用韦恩图Venny2.1.0（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/），分别将筛选所得药物、疾病相关靶点输入到List1和List2下面的栏目中，获取药物－疾病韦恩图及交集靶点。
1.4 交集靶点蛋白相互作用（PPI）网络的构建与分析
将交集靶点导入STRING11.0 数据库（https://string-db.org/）构建PPI 网络图，设置条件如下：蛋白质种类设置为“homo sapiens（人类）”，作用阈值设置为“medium confidence（0.400）”，其他条件维持设置默认。根据PPI 网络中靶点的Degree 值作为依据筛选核心靶点，并通过Cytoscape3.9.0 软件进行相应分析并获得蛋白互作关系网络。
1.5 GO分析和KEGG通路分析
利用CytoScape 中Metascape 组件对交集靶点进行GO富集分析和KEGG代谢通路富集分析，同时采用线上绘图工具微生信（http://www.bioinformatics.com.cn/）将富集结果可视化，并通过Cytoscape3.9.0 软件绘制“疾病－药物－成分－交集靶点－KEGG 通路”网络图。
1.6 分子对接
将主要化合物与PPI 网络中Drgree 值前三的交集靶点分别进行分子对接。从PubChem数据库中获取主要活性成分3D 结构，通过OpenBabel 2.4.1 软件转化成mol2 结构。同时从PDB（http://www1.rcsb.org/）数据库中获取适合化合物的蛋白晶体结构的3D 分子结构。将上述结构通过Auto Dock Tools 1.5.6 软件及Auto Dock Vina 软件进行分子对接。一般认为，结合能小于-5 kcal/mol，化合物分子与受体结合能越低，二者结合能力及发生作用的可能性越大，对接结果更加可靠。
2.1 桑寄生主要活性成分及其成分靶点
通过TCMSP数据库筛选（筛选条件：OB ≥30%，DL≥0.18）得到2个化合物，即表1中1-2。通过文献检索及SwissADME 筛查得到桑寄生2 个化合物，即表1 中3-4。通过TCMSP、SwissTargetPrediction 等数据库处理后，最终筛选得到268个靶点，见图1。
表1 桑寄生主要活性成分表Table 1 Main active components of parasitic loranthus
图1 药物－活性成分－靶点相互作用网络图Figure 1 Network diagram of drug-activity-target interaction
2.2 帕金森病相关靶点及桑寄生治疗帕金森病关键靶点
经筛选去重，最终选取223 个疾病靶点。桑寄生与PD靶点上传至Venny2.1.0后获得27个交集靶点（见图2），分别为：MAPT、APP、SLC6A3、TNF、IL6、TP53、SOD1、IL1B、ADH1C、PON1、NOS3、IFNG、MPO、TTR、MAOB、DRD2、DRD1、IGF1R、MAOA、HMOX1、GSTM1、ABCB1、NOS1、GSTP1、NQO1、INSR、GSK3B。
图2 疾病、药物交集靶点Venny图Figure 2 Venny diagram of intersection targets of diseases and drugs
2.3 PPI网络构建与分析
将27个关键靶点输入String（https://string-db.org/）中查询它们之间的相互作用关系，构建PPI蛋白互作网络图（见表2、图3）。
图3 桑寄生抗帕金森蛋白靶点相互作用网络图Figure 3 Network diagram of anti-Parkinson"s protein target interaction of mulberry parasite
表2 药物、疾病交集靶点Table 2 Intersection targets of drugs and diseases
2.4 富集分析结果
为了阐明桑寄生治疗帕金森病的作用机制，我们对交集靶点进行GO及KEGG富集分析。GO富集分析中（P＜0.05）生物过程（biological process，BP）、细胞组分（cell components，CC）、分子功能（molecular function，MF）的条目各637 条、40 条及31 条（见图4），KEGG 富集分析得到82条（见表3、图5）
表3 排序前20的KEGG富集条目信息Table 3 Information of KEGG enrichment items in top 20
图4 GO三合一富集柱状图Figure 4 Histogram of GO enrichment in three phases
图5 KEGG通路分析中排名前20的通路图Figure 5 Top 20 pathways in KEGG pathway analysis
2.5 “疾病－药物－活性成分－关键靶点－KEGG 通路”网络构建
将桑寄生的2个活性成分、桑寄生－PD的20个交集靶点、KEGG 通路汇总建立表格后导入Cyto⁃scape3.9.0 软件中构建桑寄生抗PD 的“疾病－药物－活性成分－交集靶点－KEGG通路”网络图（见图6）。
图6 “帕金森病－桑寄生－活性成分－交集靶点－KEGG通路”网络图Figure 6 Network diagram of"Parkinson"s disease-Mulberry parasite-active component-intersection target-KEGG pathway"
2.6 分子对接结果
经筛选，degree值前三的交集靶点是TNF（PDB ID:2AZ5）、IL6（PDB ID:1ALU）与TP53（PDB ID:4KVP）。分别将4种活性成分与上述靶点进行VINA分子对接，可以发现，除甲基丁香酚与IL6、4KVP 结合能大于-5 kcal/mol外，其余结合能均远小于-5 kcal/mol，能够形成较为稳定的构象结构。分子对接结果见表4。
表4 分子对接结果Table 4 Molecular docking results
帕金森病（Parkinson"s disease）可归属于祖国医学“颤证”“颤振”“振掉”“震颤”等范畴。病人常因“年老体衰、情志失调、饮食不节、劳逸过度”等病因导致气血阴精亏虚，风火痰瘀互结，肝风内动，筋脉失养。病位在经脉，与肝、脾、肾关系密切。总属本虚标实，以肝肾亏虚、风阳内动证最为常见，故治疗尤以补益肝肾、息风通络为主[4，17-18]。而桑寄生具有补肝肾、强筋骨功用，被广泛应用于帕金森病的中医治疗中。
PD 以黑质多巴胺神经元变性坏死为主要病理变化，但具体机制尚不明确。除环境、遗传、神经系统老化等因素外，更多认为PD 是在多因素交互作用下，通过氧化应激、线粒功能紊乱、神经炎性或免疫反应、钙稳态失衡、兴奋性毒性、细胞凋亡等机制导致黑质多巴胺能神经元大量变性、丢失，最终发病。而本文通过网络药理学研究，也证实了桑寄生主要通过影响炎症反应、氧化应激、细胞凋亡等途径发挥抗PD的作用。
经筛选，共获取桑寄生4种抗PD的主要活性成分，包括槲皮素、豆甾醇、藏花醛及甲基丁香酚。机体活性氧（ROS）产生、清除速率失衡，导致线粒体功能障碍、氧化性DNA损伤、神经炎症等一系列氧化应激反应[19]，槲皮素具有调节细胞凋亡[20]、抗炎、抗氧化应激等多种生物作用[21]，可通过活化抗氧化信号通路和抑制LRRK2 激酶活性，调节具有炎症介质调控作用的MAPK信号转导通路，降低LRRK2突变在PD转基因模型果蝇的神经毒性，保护脑内多巴胺能神经元[22]。小胶质细胞作为大脑中重要的免疫细胞，其过度的激活或持续的炎性反应会产生神经毒性作用，导致神经元损伤、丢失，最终引起帕金森病、阿尔茨海默症等神经退行性疾病。豆甾醇可通过抑制p38、ERK 和NF-κB通路的激活来减轻小胶质细胞炎症反应，发挥神经保护作用，改善此类疾病[23-24]。除典型的运动症状外，嗅觉减退、抑郁、痴呆等感觉、精神认知障碍在帕金森病中也十分常见。豆甾醇可通过增强胆碱能神经传递系统介导的激活雌激素或NMDA受体改善由东莨菪碱导致的小鼠认知功能障碍[25]。藏花醛是一种单萜醛，主要存在于番红花属植物和半人马属植物中。研究表明，藏花醛可以通过促进帕金森病动物模型多巴胺能神经元分化和存活、抑制α-突触核蛋白（α-synuclein，α-Syn）纤颤/聚集发挥抗帕金森病治疗作用[15]。此外，藏花醛也可通过抗炎、抗凋亡、抗水肿等途径发挥神经保护作用[16]。实验表明，甲基丁香酚可以明显提高大鼠脑组织中GSH、SOD、CAT的活性，降低MDA的含量，发挥抗氧化作用，保护神经元[26]。而除了抗氧化作用外，以丁香酚为主要成分的丁香挥发油在抗焦虑、抗抑郁、抗炎等方面也具有良好作用[27-30]。
靶蛋白的自由度与该靶点在疾病治疗中的重要性呈正相关。肿瘤坏死因子（TNF）、白细胞介素-6（IL6）、肿瘤抑制因子（TP53）作为度值前三的靶蛋白，很可能是桑寄生抗帕金森病的关键靶点。为此，我们采取了分子对接技术进行了验证。常说的TNF是指由巨噬细胞分泌的TNF-α，可参与经典和非经典Caspas 途径、NF-KB和JNK信号通路等干预细胞凋亡过程。IL-6是由T 细胞、B 淋巴细胞、巨噬细胞等产生，可被IL-1、TNF 等细胞因子激活表达，参与机体免疫应答及炎性反应，是一种典型的炎性因子。IL-6 与其受体蛋白结合后激活的Janus 激酶（JAK），可以激活Ras/Raf 途径、磷酸肌醇3 激酶（PI3K）-蛋白激酶的激活B（PKB）/Akt通路，通过作用于不同细胞产生促炎或抑炎反应。TP53 可作用于B 细胞淋巴瘤-2（Bcl-2）家族蛋白相或PI3K/Akt、MAPK 等信号通路，调控细胞增殖、细胞凋亡、炎症反应等多种细胞效应及信号转导[31-33]。正常情况下，TP53可上调线粒体谷氨酰胺酶2（GLS2），促进线粒体代谢、呼吸，维持氧化还原稳态。而高度表达的P53 会抑制下游蛋白增殖细胞核抗原（PCNA）的生成，致使DNA 氧化损伤、多巴胺能神经元变性凋亡[33-35]。众多研究已表明，TNF-α、IL-6 及TP53 因子水平与PD密切相关，这可能与抗氧化应激功能下降（如TP53 上调）或α-突触核蛋白激活小胶质细胞释放大量TNFα、IL-6[36]，导致机体黑质部位出现严重的氧化应激及炎症反应，一方面促使线粒体膜电位改变，引起线粒体死亡。另一方面，也可激活促凋亡蛋白（Bax），抑制抗凋亡蛋白（BCL-2）[37]，促使细胞凋亡，最终引起DA 能神经元损伤[38-41]。
富集分析结果显示，桑寄生治疗PD的KEGG 信号通路主要涉及HIF-1、MAPK、PI3K-Akt 以及IL-17 等信号通路，以及氧化应激、细胞增殖、细胞迁移、催化活性的负调控、小分子代谢过程的调控等生物过程。MAPK信号通路主要分为4个亚家族，包括细胞外信号调节激酶（ERK）、c-Jun N 末端激酶/应激活化蛋白激酶（JNK/SAPK）、p38丝裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）及细胞外信号调节蛋白激酶5（ERK5）信号转导通路。其中，细胞外信号调节激酶ERK 信号通路（Ras-Raf-MEK-ERK）被称作经典的MAPK 信号通路，遵循MAPK 信号转导通路的三级激酶级联反应。Ras 蛋白作为该途径的上游蛋白，被多种刺激因子激活后，可与Raf-1 结合并使其磷酸化、转为活化状态。而被Raf-1磷酸化激活的MEKs后，也可通过磷酸化反应激活ERKs。ERK主要存在于神经系统中，参与各种神经生理病理过程[42]，具有调节细胞增殖与分化、细胞形态、细胞凋亡等功能，同时对学习、记忆等也有重要意义[43-46]。ERK 信号通路与PD 关系密切，有研究表明，PD 患者黑质中p-ERK 颗粒聚集数明显高于正常老年组[42，47]。刘自华等通过对小鼠黑质部位进行转录组测序，发现PD 模型小鼠较正常组ERK、P38 基因表达下降，认为其细胞增殖、分化及形态维持等功能受到破坏，神经受损，最终导致PD 发生[48]。也有研究报道，ERK 信号通路参与PD 过程与炎性介质有关。炎性因子TNF-α可激活ERK 信号通路[49]，电针在降低鱼藤酮诱导的PD 模型大鼠中脑黑质内ERK 信号通路的表达水平的同时，也降低了TNF-α 的表达[42]。此外，PI3KAkt 信号通路在帕金森疾病中的作用也不容小觑。激活的磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）通过第二信使PIP3 活化胞内的蛋白激酶B（pro⁃tein kinase B，PKB/AKT），进而激活雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR），促进细胞代谢，抑制细胞自噬[50]。研究表明，抑制mTOR 的激活可以增强自噬过程，清除α-突触核蛋白，保护多巴胺能神经元，达到治疗PD的作用[48]。
桑寄生可以通过TNF、IL6、TP53、HMOX1、IL1B 等多靶点作用于MAPK、PI3K-Akt等信号通路，影响炎症反应、氧化应激、细胞凋亡及增殖等生物过程，最终达到治疗PD的作用，体现了桑寄生多成分、多靶点、多通路的作用特点。
（利益冲突：无）
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