刘奕清，刘续立*，房升又，马佳伟,2，蔡小东,2，贾切，乐有章
1.长江大学香辛作物研究院，湖北 荆州 434025 2.荆州佳之源生物科技有限公司，湖北 荆州 434025 3.武汉市农业科学院林业果树研究所，湖北 武汉 430073
蚜虫(Aphidoidea)是一种植食性昆虫，因其严重危害植株和易大面积传播的特点，已成为一种世界性害虫[1]。蚜虫在生长发育过程中会吸食植物汁液、蜕皮和分泌蜜露，这些行为会影响植物光合作用，同时还会导致病毒病在田间作物上传播，造成农作物品质下降，减产甚至绝收[2,3]。高粱蚜(MelanaphissacchariZehntner)属半翅目蚜科，分布于世界各地，主要为害高粱和玉米等多种作物，一般从下部叶片向上蔓延，刺吸汁液，排出大量蜜露，传播高粱红条病毒病。目前，主要施用化学农药对高粱蚜进行防治[4]，但化学农药往往存在毒性强、农药残留、污染环境和危害人体健康等问题，以致于科学家迫切希望寻找防治害虫的绿色策略[5,6]。植物源杀虫剂因其生态友好、无残留、可生物降解等特性而逐渐引起科学家的关注[7]。随着对植物农药的深入研究，发现植物提取物可作为杀虫剂、驱虫剂和引诱剂来控制害虫；
也可作为生长抑制剂来调控害虫的生长发育[8]。例如，香茅精油微乳液可以显著抑制朱砂叶螨的产卵[9]，南非醉茄根提取物对赤拟谷盗的生长、发育、蜕皮和变态均有抑制作用[10]，紫茎泽兰粗提物对草地贪夜蛾的生长发育及繁殖也有显著的影响[11]。因此，植物源杀虫剂是探索蚜虫防治的重要途径之一。
生姜(ZingiberofficinaleRoscoe)作为药食两用的香辛作物，在我国中部、东南部和西南部地区均有种植。生姜中富含各种功能性成分，具有很强的杀菌、杀虫和驱虫特性[12]。例如生姜提取物可以显著抑制果蝇的交配[13]，也能抑制粉虱的产卵，驱赶粉虱的成虫[14]，姜精油能对小菜蛾表现出较强的毒性和驱避性[15]。因此，生姜提取物作为植物源农药具有潜在的开发应用前景。目前，对生姜的利用多在生姜的姜块，而生姜地上茎叶在采收时往往被随意丢弃于田间。据长江大学香辛作物研究院近年来田间调查显示，当生姜种植田附近的辣椒、菜豆、玉米、花椒等农作物有蚜虫种群发生时，而生姜植株茎叶上却未见蚜虫危害，但生姜作物的杀虫作用和杀蚜机理却鲜有报道。因此，本研究以生姜茎叶作为提取材料，以高粱蚜(MelanaphissacchariZehntner)作为靶标害虫，研究生姜茎叶提取物(Ginger shoot extract，GSE)对高粱蚜生长发育和防御酶活性的影响，以期为开发基于生姜的植物源杀虫剂提供科学依据。
1.1 供试蚜和植物
无翅成蚜种群采自湖北省荆州市太湖农场试验基地的玉米植株上，经中国农业大学植物保护学院黄欣蒸老师鉴定为高粱蚜。蚜虫接种在实验室种植的菜豆植株上，于(25 ± 5)℃、相对湿度约(65 ± 5)%、光周期12h(L)：12h(D)的光照培养箱中饲养，繁育5代后挑选7日龄的蚜虫用于试验。生姜品种为凤头姜，购自湖北省恩施市宣恩县李家河镇菜市场，在温室中进行种植，待生长至8～10片真叶时收集凤头姜的茎叶用于试验。
1.2 生姜茎叶提取物(GSE)的制作
采用索氏抽提法，将生姜茎叶样品烘干磨碎，样品分为5份，每份5g，放入折好的滤纸中，滤纸塞入抽滤瓶中，再往瓶中以质液比1∶10的比例加入50mL无水乙醇作为提取剂，设置温度为80℃，抽提6h后，提取液移至圆底烧瓶，打开旋转蒸发仪，温度设置为80℃，浓缩至稠膏状，收集提取物进行称重。重复以上步骤，增加试验样品量，-80℃保存。
1.3 高粱蚜产仔数、蜕皮数、死亡率和体重的测定
采用叶碟法[16]进行测定。将生姜茎叶提取物(GSE)用10%的乙醇配制成浓度分别为5、10、15mg/mL的溶液，随机选取15只无翅成蚜和30只无翅若蚜(成蚜选取7日龄蚜虫，若蚜选用试验中成蚜繁殖的蚜虫)，置于装有叶子圆片的培养皿(直径9cm，高度1.5cm)中。然后将培养皿置于光照培养箱中[温度(22 ± 2)℃，相对湿度(65 ± 5)%，光周期12h(L)：12h(D)]。以10%乙醇为对照(CK)，将各处理的叶片在不同溶液中浸泡3～5s，每个处理重复3次。培养1、3、5d后测定产仔数、蜕皮数和若蚜死亡率，并在培养0、1、3、5d测定10蚜重。产仔数、蜕皮数和体重的下降比例(抑制率P)均按对照组与处理组观测值之差与对照组观测值之比进行计算。各处理组的若蚜死亡率和校正死亡率按以下公式计算：
(1)
(2)
式中:P1为死亡率;K为每个时间点内总死亡虫数;N为处理总虫数；
P2为校正死亡率;Pi为处理组死亡率;P0为对照组死亡率。
如果对照死亡率低于5%，则不需要校正；
如果对照死亡率在5%～20%之间，按式(2)进行校正；
如果对照死亡率超过20%，则需要重新进行试验。
1.4 超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和乙酰胆碱酯酶(AChE)活性测定
同样采用叶碟法测定在15mg/mL溶液处理下高粱蚜体内SOD、POD和AChE的活性，在1、3、5d时收集存活的蚜虫，-80℃保存。SOD、POD和AChE的样品制备及活性检测均按照各酶活检测试剂盒说明书进行操作(南京建成生物工程研究所，A001-1-1、A084-1-1；
苏州格锐思生物科技有限公司，G0907F)。
1.5 数据分析
采用Microsoft Excel 2016进行数据整理，SPSS 20.0软件用于方差分析和Tukey’s HSD多重比较，SigmaPlot 14.0软件用于生成图形。
2.1 GSE对高粱蚜产仔数的影响
如图1所示，在利用5、10、15mg/mL的GSE饲喂高粱蚜成蚜5d内，其产仔数相比对照(CK)呈下降趋势，且随着GSE浓度的升高，对高粱蚜产仔数的抑制作用越强，15mg/mL的GSE饲喂与CK的产仔数呈显著差异(P<0.05)。饲喂1d时，5、10、15mg/mL的GSE处理下高粱蚜的产仔数与CK无显著差异。饲喂3d时，3种浓度GSE处理下的高粱蚜产仔数均显著低于CK，且在15mg/mL的GSE处理下高粱蚜的产仔数最低，为9.33个。饲喂5d时，15mg/mL的GSE处理下高粱蚜的产仔数显著低于其他2个浓度，且相比CK产仔数下降了58.58%，而5mg/mL和10mg/mL的GSE处理下高粱蚜的产仔数与CK无显著差异。由此表明，整个处理期间GSE对高粱蚜的产仔数有抑制作用，但随着处理时间的延长，5mg/mL和10mg/mL的GSE对高粱蚜产仔数相比CK的抑制效果不明显，15mg/mL的GSE对高粱蚜的产仔数抑制效果相比CK有显著区别，且抑制作用最强。
注：不同小写字母表示组间差异显著(P<0.05),图2～4同。
图1 不同浓度GSE处理下高粱蚜的产仔数 Fig.1 The litter size of sorghum aphid treated withdifferent concentrations of GSE
2.2 GSE对高粱蚜蜕皮数的影响
如图2所示，在利用5、10、15mg/mL的GSE饲喂高粱蚜成蚜5d内，其蜕皮数相比对照(CK)呈下降趋势，且随着GSE浓度的升高，对高粱蚜蜕皮数的抑制作用越强，3种浓度饲喂与CK的蜕皮数相比均有显著差异(P<0.05)。饲喂1d时，3种浓度GSE下高粱蚜的蜕皮数相比CK不显著。饲喂3d时，CK处理下的高粱蚜蜕皮数为10.33个，显著高于3种浓度GSE处理下的蜕皮数，而15mg/mL的GSE处理下的高粱蚜蜕皮数最少，相比CK下降了83.83%，也显著低于其他2种浓度下的蜕皮数。饲喂5d时，5mg/mL和10mg/mL GSE处理下的高粱蚜蜕皮数均显著低于CK，且两者之间没有显著差异，分别为10.33个和12.33个，而15mg/mL GSE处理下的高粱蚜蜕皮数最少，相比CK蜕皮数下降了93.81%。由此表明，GSE处理对高粱蚜的蜕皮数有抑制作用，且随着时间的延长，3种浓度对高粱蚜蜕皮数相比CK仍有显著抑制效果，15mg/mL GSE处理下对高粱蚜蜕皮数的抑制效果最强。
图2 不同浓度GSE处理下高粱蚜的蜕皮数Fig.2 The molting of sorghum aphid treated withdifferent concentrations of GSE
2.3 GSE对高粱蚜体重的影响
如图3所示，在利用5、10、15mg/mL的GSE饲喂高粱蚜成蚜5d内，其体重相比对照(CK)呈下降趋势，且随GSE浓度的升高，对高粱蚜体重的增长抑制作用越强，3种浓度饲喂与CK的高粱蚜体重相比均有显著差异(P<0.05)。在饲喂1d时，15mg/mL GSE处理下的高粱蚜体重显著低于CK，仅有5.07mg，相比CK体重下降了13.63%，而其他2种浓度处理下高粱蚜的体重分别与CK相比无显著差异。饲喂3d时，10mg/mL GSE处理下的高粱蚜体重显著低于CK，但高于15mg/mL GSE处理下的高粱蚜体重，且5mg/mL和10mg/mL GSE处理下的高粱蚜体重无显著差异，分别为6.73mg和7.27mg。饲喂5d时，15mg/mL GSE处理下的高粱蚜体重最低，相比CK体重下降了32.32%，但与10mg/mL GSE处理下的高粱蚜体重之间无显著差异。由此表明，GSE会抑制高粱蚜体重的增长，且随着时间的延长，3种浓度对高粱蚜体重增长相比CK仍有显著抑制效果，10mg/mL和15mg/mL浓度处理对高粱蚜体重的抑制效果最强。
图3 不同浓度GSE处理下高粱蚜的体重Fig.3 The weight of sorghum aphid treated withdifferent concentrations of GSE
2.4 GSE对高粱蚜若蚜死亡率的影响
如表1所示，在利用5、10、15mg/mL的GSE饲喂高粱蚜若蚜5d内，其死亡率相比对照(CK)逐渐增加，且随着GSE浓度的升高，高粱蚜若蚜的死亡率越高，3种浓度饲喂与CK的高粱蚜死亡率相比均有显著差异(P<0.05)。饲喂1d时，10mg/mL GSE处理下的若蚜死亡率与15mg/mL GSE的处理无显著差异，但显著高于CK处理和5mg/mL GSE处理下的若蚜死亡率。饲喂3d时，3种浓度处理下若蚜死亡率之间存在显著差异，且均高于CK，分别达到了93.33%、72.22%和35.56%。饲喂5d时，15mg/mL GSE处理下高粱蚜的死亡率最高，达到95.56%，而CK处理下的死亡率仅为20.00%。经式(2)校正后，饲喂1d时，5mg/mL GSE的若蚜死亡率与CK相比无显著差异，10mg/mL和15mg/mL GSE处理下若蚜死亡率显著高于CK，而饲喂3d和5d时，3种浓度处理下对高粱蚜的死亡率均显著高于对照。由此表明，GSE会增加高粱蚜若蚜的死亡率，且随着时间的延长，3种GSE处理对高粱蚜若蚜死亡率相比CK仍有显著升高，15mg/mL GSE对高粱蚜若蚜的死亡率和校正死亡率均为最高。
表1 不同浓度GSE处理下高粱蚜若蚜的死亡率Table 1 Mortality of nymph aphids treated with different concentrations of GSE
2.5 GSE对高粱蚜体内SOD、POD和AChE活性的影响
如图4所示，在15mg/mL的GSE饲喂5d内，对高粱蚜体内SOD、POD和AChE的活性相比对照(CK)均有显著差异(P<0.05)。由图4(a)可知，GSE可以显著激活5d内的高粱蚜SOD活性，但随着时间的延长SOD活性呈逐渐下降的趋势。在饲喂1d时，处理组的SOD活性最强，为1.31U/mg。在3d时处理组SOD活性相比CK差异最大，相比CK活性增加23.85%；
在5d时处理组SOD活性相比CK差异最小，相比CK活性增加14.29%。由图4(b)可知，在饲喂1d时，15mg/mL的GSE可以显著激活高粱蚜体内POD活性，活性增加20.00%。随着时间的延长，处理组的POD活性有明显的下降，且在3d时处理组的POD活性相比CK无显著差异，5d时处理组的POD活性显著低于CK，活性下降了43.48%，说明处理后期高粱蚜体内POD活性受到抑制。如图4(c)所示，GSE可以显著抑制5d内的高粱蚜AChE活性，且随着时间的延长，处理组和CK的AChE活性均呈现先上升后下降的趋势。饲喂1d时，GSE对高粱蚜体内AChE活性抑制效果最强，活性下降了96.90%。饲喂3d和5d时，高粱蚜体内AChE活性均显著低于CK。
图4 GSE处理下高粱蚜体内SOD、POD和AChE活性Fig.4 SOD，POD and AChE activities in sorghum aphids treated with GSE
本研究结果显示，生姜茎叶提取物(GSE)对高粱蚜的生长发育有抑制作用并能致其若蚜死亡。试验发现，GSE可以显著抑制高粱蚜的产仔，且在5d时，15mg/mL的GSE饲喂下高粱蚜的产仔数相比CK下降了58.58%。类似地，TAJDAR等[17]研究发现薄荷提取物能显著抑制桃果实蝇的产卵，杨振德等[18]研究发现苦豆子中的生物碱也能显著抑制柳蓝叶甲的产卵。本研究结果表明GSE中有可能含有抑制高粱蚜产仔的特有活性成分，但其成分有待进一步鉴定。TOYOFUKU等[19]研究发现植物来源的葫芦素B可以显著抑制黑腹果蝇体内蜕皮激素的生物合成，进而抑制幼虫蜕皮直至死亡。本研究结果显示，GSE能显著抑制高粱蚜的蜕皮，且在5d时，15mg/mL的GSE饲喂下高粱蚜蜕皮数相比CK下降了83.83%，说明GSE中也可能具有抑制高粱蚜蜕皮激素合成的物质。本研究也发现GSE处理下高粱蚜的体重显著低于对照，且15mg/mL的GSE饲喂5d时，体重相比对照下降了32.32%。类似地，张艳等[20]研究发现，薰衣草精油处理下斜纹夜蛾幼虫体重显著低于对照，且其对斜纹夜蛾幼虫有胃毒作用和拒食作用，严重抑制其生长发育，田万里等[21]研究也发现，狭叶菖蒲乙醇提取物能导致棉铃虫幼虫体重增加量减少，且其对棉铃虫幼虫有胃毒作用和拒食作用，从而生长抑制率升高。这些结果表明，植物提取物中可能具有对生物有害或有拒食作用的物质，影响害虫的生长发育。因此，GSE中也可能含有对高粱蚜产生胃毒作用或拒食作用的成分，从而影响高粱蚜发育。本研究发现，GSE处理下可显著增加高粱蚜若蚜的死亡率。类似地，MERIAM等[22]发现棚架藤甲醇提取物会显著提高飞蝗若虫的死亡率，王谆静等[23]发现八角茴香浸提液对白背飞虱有较好的杀虫活性。这些结果也暗示GSE中含有对高粱蚜若蚜产生毒性的物质，引起了若蚜的死亡。
害虫耐药性是目前研究害虫防治的热点之一，而昆虫体内相关防御酶是研究害虫耐药性的重要因素[24,25]。SOD和POD是昆虫体内重要的抗氧化酶，当昆虫受到有毒物质胁迫时，会激活昆虫体内SOD和POD的活性，将其体内的超氧自由基维持在较低水平以防止自由基毒性[26]。本研究发现GSE对高粱蚜具有杀虫活性，15mg/mL GSE处理下高粱蚜体内SOD活性显著高于对照。类似地，程作慧等[27]研究发现在迷迭香精油处理下可以显著激活朱砂叶螨体内SOD和POD的活性；
CZERNIEWICZ等[28]研究发现香棉菊和孔雀草精油处理诱导了桃蚜和禾谷缢管蚜体内ROS的产生，导致2种蚜虫体内SOD活性显著升高；
姬兰柱等[29]研究发现细辛精油分离出的馏分显著提高玉米螟和黏虫体内的SOD活性。这些结果表明高粱蚜在15mg/mL GSE处理下可以激活体内SOD的活性，应对氧化损伤。然而，本研究也发现15mg/mL GSE处理下高粱蚜体内POD活性表现出了先激活后抑制。这与宋程飞等[30]研究发现绿薄荷茎叶提取物对小菜蛾体内POD活性表现为先上升后下降，马新耀等[31]研究发现藿香精油对朱砂叶螨体内POD活性表现为先激活后抑制的结果相似。产生这种现象的原因可能是植物提取物处理初期扰乱了害虫体内活性氧的平衡，致使体内自由基的积累，通过激活保护酶活性来清除自由基，缓解虫体损伤，但随着处理时间延长，害虫体内有毒物质增加，自由基迅速积累，从而导致部分防御酶开始受到抑制，对虫体的毒害作用增强[32]。AChE是昆虫体内的解毒酶，也是神经系统中的一种重要水解酶，可以催化神经递质中胆碱的水解来阻止神经冲动[33]。与SOD和POD的活性相比，本研究发现15mg/mL GSE处理下高粱蚜体内AChE活性受到显著的抑制。类似地，ZHOU等研究发现[34]八角果实提取物可以抑制桃蚜体内AChE的活性，导致桃蚜神经系统紊乱，虫体死亡。CARLOS等[35]研究发现灰白银胶菊提取物可以显著抑制草地贪夜蛾体内AChE活性，导致其虫体死亡，ELSAYED等[36]研究发现茴芹油也能显著抑制二斑叶螨体内AChE活性。这些研究表明植物提取物中可能含有抑制害虫体内AChE活性的物质，这些物质会导致害虫神经系统紊乱，直至虫体死亡。上述结果表明，GSE中可能含有引起高粱蚜防御机制的活性成分，这些成分是导致高粱蚜死亡的重要原因，但其主要功能成分还不明晰。可见研究昆虫防御酶对植物源杀虫剂的作用机理和昆虫的抗药性具有重要意义。
本研究结果表明，GSE有抑制高粱蚜的正常发育和繁殖的作用，也会导致高粱蚜的死亡，这可能是通过影响高粱蚜体内的防御酶活性造成的。本研究探讨了GSE对高粱蚜的饲喂毒性和虫体防御酶应答机制，但GSE作用于蚜虫的主要活性成分及其杀虫成分的作用机理尚不清楚，还需要进一步研究。
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