刘 洋 ,李剑奎 ,沙伟君 ,崔立然 ,王 辉 ,徐 浩 ,张怀胜,宋 波,薛 徽∗
(1.齐齐哈尔医学院附属第一医院,黑龙江 齐齐哈尔 161041;2.齐齐哈尔医学院,黑龙江 齐齐哈尔 161006)
颌骨损伤是口腔颌面外科与创伤外科的常见病与多发病,常因直接暴力,间接暴力,肿瘤,炎症及医源性损伤等引起[1]。颌骨损伤后主要表现为开口受限,咬合关系错乱,面部肿胀等临床特征,因其特殊解剖位置及功能特点,颌骨缺损修复过程近年来备受关注[2-3],如何快速、安全、有效治疗口腔颌面部损伤,促进缺损区新骨形成已成为目前亟待解决的科学问题。骨损伤发生后,骨组织内血管断裂,血小板、纤维蛋白及大量红细胞自血管内释放,在损伤区激活凝血系统进而形成血肿[4],与此同时,中性粒细胞,巨噬细胞及淋巴细胞等炎症细胞迅速募集至骨损伤区,吞噬组织碎片及病原体,释放大量的趋化因子及炎症因子[5-6]。来自骨膜及骨髓腔内的间充质干细胞在多种炎症因子的刺激下,迅速聚集至骨损伤区并向成骨细胞、成软骨细胞及成纤维细胞分化,进而形成骨痂,最终骨痂在成骨细胞及破骨细胞的共同作用下被板层状骨取代,骨损伤修复完成[7]。
骨痂在骨组织损伤修复过程中具有维持组织形态、调控损伤区初期稳定性及提供基质矿化空间等重要作用。蛋白聚糖是构成骨痂的重要组成部分之一,能够有效维持骨痂机械强度,并为损伤组织提供保护性屏障。DMP1-PG 是一类新发现的蛋白聚糖,通过对骨损伤样本进行高通量测序,我们发现其与骨损伤修复关系密切。DMP1 是在牙本质cDNA 克隆过程中发现的一类酸性细胞外基质蛋白,DMP1-PG 是其糖基化形式[8]。DMP1-PG 在软骨基质及骨基质中呈高表达,DMP1-PG 缺失后,四肢长骨发育呈现老龄化骨病特征,此外颌骨及颅骨发育异常,表现为颞下颌关节过度磨损及颅骨颅缝早闭特征。然而DMP1-PG 在颌面部骨组织中的损伤修复作用暂无相关研究及报道。
前期研究过程中,通过构建颌骨骨缺损模型,我们发现DMP1-PG 在野生型小鼠颌骨缺损修复组织中大量表达,为进一步探讨DMP1-PG 在颌骨缺损修复中的作用,我们构建DMP1-PG 点突变(S89G-DMP1)小鼠,通过对比二者在颌骨创伤修复中的差异,探究DMP1-PG 对小鼠颌骨损伤修复的影响及相关作用机制。
1.1 实验动物
实验组S89G-DMP1 小鼠,SPF 级,雄性,8 周龄30 只,体重24～26 g,由上海同济大学口腔医学院孙瑶教授课题组设计,辽宁长生生物技术股份有限公司[SCXK(辽)2020-001]培育,对照组WT 小鼠为C57BL/6J 品系,SPF 级,雄性,8 周龄30 只,体重24～26 g,购于辽宁长生生物技术股份有限公司[SCXK(辽)2020-001],在齐齐哈尔医学院实验动物中心屏障环境[SYXK(黑)2021-013]饲养,上述实验动物饲养给与12 h 无光/12 h 人工光照饲养环境,饲养温度22℃～25℃,自由进食与饮水。所有动物相关实验方案均经齐齐哈尔医学院伦理委员会批准(QMU-AECC-2021-56)。所有实验设计及操作均符合动物实验学“3R”原则。
1.2 主要试剂与仪器
HE 染液(上海生工生物工程有限公司,批号E607318);甲苯胺蓝染液(上海生工生物工程有限公司,批号A600962);TRIzol 试剂盒(Invitrogen 公司,批号15596018);anti-DMP1-C 及anti-DMP1-N(爱玛特医药科技上海有限公司);anti-ALP(Abcam公司,批号ab224355);anti-RUNX2(Abcam 公司,批号ab76956);反转录试剂盒(TaKaRa 公司,批号PR036A)。
实时荧光定量PCR 仪(Lightcycler 96);Bio-Rad PCR 仪(C1000 Touch);石蜡切片机(Thermo,HM325);倒置荧光显微镜(尼康,TS2R);显微计算机断层micro-CT 机(SCANCO,Switzerland)。
1.3 实验方法
1.3.1 S89G-DMP1 小鼠的构建
根据野生型小鼠(C57BL/6J)全基因组序列,构建所有DMP1 蛋白糖基化位点外显子上、下游6.6 kb 及8.2 kb 基因序列同源重组臂,在DMP1 第6 外显子下游179 bp 敲入Neo 阳性序列,质粒构建完成后,通过电转技术,将质粒转入小鼠胚胎干细胞,后将3 个阳性克隆移植入Balb/c 假孕小鼠子宫内。已获得5 个嵌合体的雄性小鼠与野生型小鼠(C57BL/6J)杂交,获取F1 代小鼠。通过杂交获得的雄性小鼠与 B6.129S4-Gt (ROSA) 26-Sortm1(FLP1)Dym/Rain J 雌性小鼠杂交,确定移除Neo 序列,通过基因型鉴定确定Neo 移除序列的子代小鼠。经鉴定获得的S89G-DMP1 小鼠在实验使用时均须经过基因型鉴定。
1.3.2 下颌骨缺损模型构建
根据相关文献[9]建立下颌骨骨缺损模型。选用8 周龄雄性WT 小鼠及S89G-DMP1 小鼠,作为实验对象。腹腔注射戊巴比妥钠(剂量:50 mg/kg,浓度:0.3%),麻醉显效后,将右侧下颌骨表面皮肤备皮并充分消毒,切开下颌表面皮肤,钝性分离咬肌,暴露下颌骨,使用牙科涡轮机在下颌骨体部构建直径1.2 mm 的缺损洞形,该缺损洞形需穿通下颌骨。洞形制备完成后生理盐水局部冲洗,分层缝合咬肌与表面皮肤。术中需注意保护下颌骨骨膜,避免因人为手术因素造成二组之间的差异。术后3 d 内腹腔注射镇痛药及抗生素。
1.3.3 Micro-CT 扫描
颌骨损伤模型构建完成后14 d 及28 d 收取样本,选择合适管径的扫描管,扫描精度选取10 μm,扫描功率14 W,扫描电流200 μA,扫描电压70 kV。
1.3.4 样本脱钙,包埋,HE,甲苯胺蓝染色及免疫荧光染色
颌骨损伤模型构建后7 d、14 d 及28 d 收取组织样本,将下颌骨置于4℃浓度为4%的多聚甲醛溶液中24 h 后,放入10%乙二胺四乙酸溶液中脱钙14 d。样本脱钙完成后置入自动样本脱水仪脱水、浸蜡,组织包埋机包埋后切片,切片厚度为4 μm。根据HE 及甲苯胺蓝试剂盒要求进行相应染色,中性树胶封片,显微镜拍照。
石蜡切片水化后,透明质酸抗原修复,山羊血清封闭处理。将组织切片与以下一抗:anti-ALP(1 ∶500),anti-RUNX2(1 ∶500),anti-DMP1-N(1 ∶500),anti-DMP1-C(1 ∶500)进行共同孵育并4℃过夜,PBS 溶液洗涤三次后与荧光二抗Alexa Fluor 546 IgG(1 ∶1000)室温孵育1 h,使用DAPI 进行细胞核复染,荧光显微镜下观察、拍照。
1.3.5 RT-qPCR 检测
下颌骨缺损模型构建完成后7 d 及14 d 收取样本,将样本放入含1 mL TRIzol(Invitrogen)溶液的EP 管中,根据试剂盒要求提取损伤样本RNA,紫外光分光光度仪测量RNA 浓度,使用TaKaRa 逆转录试剂盒20 μL 体系将RNA 逆转录为cDNA。根据RT-qPCR 试剂盒使用说明书配置10 μL 扩增体系,分析靶基因mRNA 表达水平,引物序列见表1。
表1 RT-qPCR 引物序列Table 1 Primer sequences for RT-qPCR
1.3.6 细胞培养与ALP 染色
选取8 周龄WT 小鼠及S89G-DMP1 小鼠,提取下颌骨骨髓间充质干细胞(mandible bone marrow stromal cells,mBMSCs)。充分麻醉诱导后,将小鼠下颌骨分离,剪碎,反复冲洗,1200 r/min 分离心5 min 后,将上清液及碎骨片吸出,用含有α-MEM,10%胎牛血清及1%青霉素/链霉素的普通培养基再次离心重悬,置于培养皿中培养,当细胞密度达到80%以上时进行传代。P3 代后,将细胞置于含有β-甘油磷酸钠的成骨诱导培养基中成骨诱导21 d,根据ALP 试剂盒使用说明对其进行ALP 染色,显微镜拍照。
1.4 统计学方法
所有实验样本应用GraphPad Prism 7.0 软件进行统计学分析并绘制条形图,计量资料通过平均数±标准误差(¯x)表示,使用t检验进行两组间数据比较分析,P<0.05 表示差异具有统计学意义。
2.1 DMP1-PG 在下颌骨损伤区的表达
DMP1-PG 为DMP1 糖基化形式,即DMP1-N 端通过共价键与糖胺聚糖链连接,通过对组织样本进行DMP1-N 抗体免疫荧光染色,可观察DMP1-PG在组织中的表达。首先构建WT 小鼠下颌骨骨缺损模型,在术后14 d 收取样本,通过对骨缺损样本进行免疫荧光染色,研究发现DMP1-PG 在缺损组织内及缺损周围骨组织间大量表达。骨缺损后14 d,提取缺损组织范围内RNA,结果显示同未损伤区下颌骨相比,Dmp1 基因表达显著上调,上述结果表明DMP1-PG 可能在颌骨缺损修复过程中发挥重要的作用,见图1。
图1 DMP1-PG 在下颌骨损伤区大量表达Figure 1 DMP1-PG is abundantly expressed in the mandibular injury area
2.2 S89G-DMP1 小鼠基因型鉴定
S89G-DMP1 小鼠构建完成后进行基因型鉴定,组织样本凝胶电泳结果显示DMP1-Neo 为260 bp条带,DMP1-WT 为250 bp 条带,WT 小鼠显示为DMP1-WT 250 bp 单条带,S89G-DMP1 小鼠纯合子显示为DMP1-Neo 260 bp 单条带,S89G-DMP1 小鼠杂合子显示为260 bp 与250 bp 双条带。根据实验结果,6 号小鼠为S89G-DMP1 阳性对照,1～5 号小鼠为S89G-DMP1 纯合子,见图2。
图2 S89G-DMP1 小鼠基因型鉴定Figure 2 Genotypic identification of S89G-DMP1 mice
2.3 DMP1-PG 缺失抑制下颌骨损伤修复
为进一步探究DMP1-PG 在颌骨损伤中的作用,课题组同时构建WT 小鼠及S89G-DMP1 小鼠颌骨缺损模型,在术后7 d、14 d 及28 d 收取样本,进行组织学染色。结果显示,颌骨缺损后7 d,WT 小鼠及S89G-DMP1 小鼠骨缺损区域内均未见明显骨组织生成,损伤区内可见大量纤维样结构。术后14 d,WT 小鼠颌骨缺损区内可见部分点、片状骨小梁生成,相较于WT 小鼠,S89G-DMP1 小鼠损伤区骨组织生成能力明显减弱,损伤区仅可见极少数量的新生骨小梁,新生骨组织细小、散在的分布于颌骨缺损区;颌骨缺损后28 d,WT 小鼠颌骨缺损区内可见大量新生骨组织,主要为骨小梁样结构,新生骨组织已完整覆盖缺损区,与周围组织无明显界限,骨小梁结构成熟,HE 染色显示新生骨小梁无明显淡染,与正常下颌骨组织染色无明显差异。同WT小鼠相比,S89G-DMP1 小鼠在颌骨损伤后28 d 尚不能完成有效损伤修复,缺损区内新生骨小梁数量较术后14 d 略增加,但仍明显少于WT 小鼠,骨小梁不能完整覆盖缺损组织,新生骨组织主要表现为类骨质样结构,HE 染色表现为明显的淡染状态。术后14 d 及28 d 收取样本,进行Micro-CT 扫描,结果显示,WT 小鼠颌骨缺损区内新生骨组织量显著高于S89G-DMP1 小鼠,见图3。
图3 WT 小鼠及S89G-DMP1 小鼠下颌骨缺损组织学及影像学差异Figure 3 Histological and iconography differences of mandibular defects in WT mice and S89G-DMP1 mice
2.4 DMP1-PG 缺失抑制成骨蛋白表达
通过使用免疫荧光染色技术,观察DMP1-PG缺失后对小鼠颌骨缺损区成骨相关蛋白表达的影响。结果显示,下颌骨损伤后14 d,成骨相关蛋白DMP1-C,ALP 及RUNX2 在WT 小鼠颌骨缺损区表达量较高,表现为染色较深的红染区,主要分布于新生骨小梁周围区域。在S89G-DMP1 小鼠颌骨损伤区,上述蛋白表达量明显减低,尤其在ALP蛋白表达方面,S89G-DMP1 小鼠仅呈现极个别散在点样红染。上述结果进一步证实DMP1-PG 缺失后,成骨相关蛋白在骨损伤区生成明显减弱,见图4。
图4 成骨相关蛋白在下颌骨缺损区免疫荧光染色Figure 4 Immunofluorescence staining of osteogenesis-related proteins in the mandibular defect area
2.5 DMP1-PG 缺失抑制小鼠成骨相关因子表达
为进一步探究DMP1-PG 影响颌骨损伤修复的相关机制,应用RT-qPCR 技术对比观察颌骨损伤后7 d 及14 d 成骨相关基因及蛋白聚糖生成相关基因表达变化情况。结果显示术后7 d,WT 小鼠与蛋白聚糖生成相关基因(Acan、Bgn、Dcn及Vcan)及骨生成相关基因(Alp、Ocn、Opn及Runx2) 显著高于S89G-DMP1 小鼠,P<0.05,差异具有统计学意义。术后14 d,Dcn、Alp、Ocn及Opn在WT 小鼠缺损骨组织内表达量高于S89G-DMP1 小鼠,P<0.05,差异具有统计学意义,见图5。
图5 WT 小鼠及S89G-DMP1 小鼠下颌骨缺损后相关基因表达变化Figure 5 Changes in the expression levels of related genes after mandibular defect in WT mice and S89G-DMP1 mice
2.6 DMP1-PG 缺失抑制骨髓间充质干细胞分化
骨髓间充质干细胞在骨损伤修复过程中发挥重要的作用,通过提取下颌骨来源的BMSCs,观察DMP1-PG 缺失后对其成骨分化能力的影响。ALP染色显示DMP1-PG 缺失后BMSCs 成骨活性降低。此外,来源于S89G-DMP1 小鼠mBMSCs 培养聚集物的成骨及蛋白聚糖相关的mRNA 表达水平较WT小鼠表达明显降低。S89G-DMP1 小鼠 BMSCs 异常的成骨能力进一步证实了DMP1-PG 在调节颌骨缺损愈合中的重要作用,见图6。
图6 DMP1-PG 缺失后骨髓间充质干细胞成骨能力下降Figure 6 Decreased osteogenic ability of bone marrow mesenchymal stem cells after DMP1-PG deletion
因多种原因导致的颌骨缺损,不仅对患者的语言、咀嚼及吞咽等功能造成影响,同时也给患者造成极大的心理及社会适应障碍。颌骨缺损发生后,血肿即刻形成同时伴有炎症细胞浸润,体内间充质干细胞向成纤维细胞、成软骨细胞及成骨细胞分化,形成软骨及硬骨骨痂,最终完成骨组织再生过程[10]。在这一过程中,骨组织细胞外基质成分发挥重要的作用,包括在愈合过程中提供支撑结构,调控成骨细胞行为及功能等[11]。蛋白聚糖是细胞外基质的重要组成部分之一,尽管其在细胞外基质中含量较低,但其参与多种细胞组织活动,包括维持骨矿化基质强度,充填组织细胞间隙,粘附生长因子,调控基质矿化及骨损伤修复[12-14]。
DMP1 是最初在牙本质中被发现的酸性蛋白,在随后的相关研究中,人们发现其不仅在牙本质中表达,在其他组织包括皮肤、肌肉、乳腺、脑组织及骨组织[15]中均有表达,尤其在骨组织中呈高表达,表达量明显高于牙本质。DMP1 在体内以四种形式存在:DMP1 全长片段及水解后产物DMP1-C 端,DMP1-N 端,DMP1-N 端尚可以通过共价键与糖胺聚糖链连接,形成DMP1 糖基化形式,即DMP1-PG。作为一类新发现的蛋白聚糖,DMP1-PG 在肌肉组织[16]、骨组织矿化前沿及软骨基质中大量表达[17]。相关研究表明,DMP1-PG 缺失可导致小鼠骨脆性增加,骨组织过度衰老。
在前期研究中,我们发现DMP1-PG 在颌骨骨缺损修复组织内及周围大量表达,Dmp1 基因表达水平在损伤修复过程中显著上调,上述结果表明DMP1-PG 参与颌骨损伤修复过程。为进一步探究DMP1-PG 调控颌骨损伤修复的重要意义及机制,课题组构建WT 小鼠及DMP1-PG 点突变(S89GDMP1)小鼠下颌骨骨缺损模型,该缺损模型为稳定的颌骨膜内成骨模型。通过对二组小鼠颌骨损伤后7 d、14 d 及28 d 样本进行组织切片、染色,研究发现,DMP1-PG 缺失后,小鼠成骨能力明显减弱,WT 小鼠在建模后28 d,新生骨组织几乎完全覆盖缺损区,而S89G-DMP1 小鼠仅表现为部分骨组织修复,修复周期明显延长。上述结果表明DMP1-PG在颌骨损伤修复过程中发挥重要的调控作用。利用RT-qPCR 技术,我们检测颌骨损伤修复过程中成骨相关基因表达变化,结果显示损伤后7 d 及14 d,S89G-DMP1 小鼠成骨相关基因表达均明显低于对照组WT 小鼠,颌骨修复过程中,除成骨相关基因在DMP1-PG 缺失后发生变化,与蛋白聚糖生成相关基因同样出现表达减低趋势,这种趋势在损伤修复早期表现更加明显。上述结果表明,DMP1-PG 缺失后不仅影响骨组织生成,同样参与调控其他类型与损伤修复密切相关的蛋白聚糖的合成。
相关研究表明,骨髓来源的间充质干细胞具有较强的修复骨组织缺损的能力[18-20]。间充质干细胞在骨损伤修复过程中可直接向成骨细胞分化,同时可调控组织修复过程中的免疫活动,促进血管生成及其他类型细胞向损伤区募集[21]。本次研究中,我们提取两组小鼠下颌骨骨髓间充质干细胞并进行成骨诱导,ALP 染色可见S89G-DMP1 小鼠来源的间充质干细胞成骨能力显著低于WT 小鼠,此外,成骨相关基因及蛋白聚糖合成相关基因表达同样显著低于对照组。上述结果表明,在细胞水平,DMP1-PG 可能参与调控干细胞分化能力,进而调控骨组织损伤修复过程。
综上所述,DMP1-PG 作为一类新发现的蛋白聚糖,在颌骨组织损伤修复过程中发挥重要的正向调控作用,其机制可能与干细胞分化及蛋白聚糖合成有关,本研究为治疗颌骨损伤修复提供新的研究方向及治疗靶点。
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