杨澜，王鑫，牛勇
1.山西医科大学法医学院，山西 晋中 030600；
2.淮北市公安局刑侦支队，安徽 淮北 235000；
3.公安部刑事侦查局，北京 100006
死亡时间（postmortem interval，PMI），又称死后间隔时间或死后经历时间，是指发现、检查尸体时距死亡发生时的时间间隔。在刑事案件中，准确推断PMI 可为案件侦破提供重要线索，帮助确定案件性质、划定侦查范围、认定和排除嫌疑人等。法医学实践中，一般根据尸体现象、胃肠内容物消化程度、膀胱尿量等进行PMI 推断，但这些方法易受主观和环境因素的影响[1]。因此，更为准确的PMI 推断仍是法医病理学研究的重点和难点问题。通常情况下，同一物种不同器官细胞核中的DNA 平均含量是相对恒定的[2]。因此，越来越多的学者根据死后DNA 变化规律进行PMI 推断。近年来，随着生物化学与分子生物学相关技术的不断发展，基于DNA 推断PMI 的技术方法的应用也更加广泛，并取得了一定进展。因此，本文拟对基于DNA 推断PMI 的技术研究进行综述，以期为法医学科研和实践提供参考。
1.1 单细胞凝胶电泳（single cell gel electrophoresis，SCGE）技术
SCGE 的电泳图形似彗星，因此又称为彗星试验，最初由OSTLING 等[3]提出，后经其他学者逐步完善而发展起来，可用于检测分析死后机体组织细胞DNA的降解情况[4-5]。SCGE 的基本原理[6-7]是细胞经裂解释放出的双链DNA 解旋为单链，在电泳过程中，降解的小分子DNA 进入凝胶，带负电荷向正极泳动，经荧光染色后，可观察到其按相对分子质量大小在电泳过程中出现拖尾现象，形成彗星尾，未降解的DNA 由于分子量大而保持在原位，形成彗星头。随着PMI 的延长，DNA 降解增多，彗星头会逐渐变小，彗星尾逐渐变长[8-10]，即DNA 随着PMI 的延长逐渐降解。有研究[8]将死后0～24 h 的DNA 电泳结果大致分为3 种：（1）彗星头大且只有很短的颈尾部，有30%～45%的DNA 降解，一般出现在死后6 h 内；
（2）彗星头减小而尾变长，有60%～85%的DNA 降解，由于处于中间阶段，并未给出死后时间估计区间；
（3）彗星头颈基本不存在而彗星尾很长，约有98%的DNA 发生降解，一般出现在死后24 h 之后。
在推断PMI 时，可通过SCGE 的多种损伤参数来综合判断。研究表明，彗星拖尾的头尾长度、面积以及DNA 含量比例等参数均与PMI 具有相关性[9，11-16]，并且在脑、心肌等多种组织和细胞中得到了很好的验证[10，17-18]。SCGE具有所需样本少、简便、快捷等特点[19]，适用于样本含量较少的检材，如血痕、血滴、组织碎块等，但在实验过程中会受到多种因素的影响[15]，如在制备单细胞悬液时，细胞数过多或者过少均会造成难以统计分析的后果。因此，SCGE 需首先确保实验质量，再结合专门的分析软件，使用合适的参数建立准确的预测模型。
1.2 计算机图像分析技术
计算机图像分析技术通过对DNA 进行特殊染色，采用涂片或自动化计算机图像分析等手段分析DNA 降解情况[20]。其中Feulgen 染色技术是PMI 推断中运用时间较长且较成熟的一项技术[14]，自1924 年FEULGEN 等建立Feulgen 染色法以来，该方法就成为DNA 图像定量分析的“金标准”[21]。对于Feulgen 染色后DNA 图像分析的参数主要分为几何参数和灰度参数[14，22]。几何参数包括面积、等效直径和异形指数，主要定量反映细胞或细胞核形态（形状、大小及轮廓）规则程度的变化；
灰度参数包括平均光密度、积分光密度和平均灰度，主要反映细胞或细胞核颜色的深浅程度。因此，在进行DNA 定量时需要选择合适的参数[23]。
对于计算机图像分析参数的选择，积分光密度、平均光密度及平均灰度这3 个指标适用于PMI 推断研究[24-26]，且平均光密度和平均灰度对温度特别敏感。基于此项技术对大鼠骨骼肌[27]、肝细胞[28]、肾细胞[22]和脑组织[29]等多种来源的样本进行研究，结果均表明DNA 含量的变化与PMI 相关。计算机图像分析具有可操作性强、结果客观等优势，但在制备切片的过程中，取材、染色、固定等操作步骤均可能影响图像呈现及结果分析。同时由于此技术不能区分原核细胞和真核细胞的DNA[30]，特异性较低，适用于保存较好的组织检材，导致计算机图像分析在日常法医学鉴定实践中存在一定的局限性。
1.3 流式细胞术（flow cytometry，FCM）
FCM 是通过流式细胞仪对细胞DNA 含量进行分析的一项技术。将核酸荧光染料插入DNA 的碱基中，FCM 通过捕获被激发的荧光测定DNA 含量。在染料饱和的前提下，每个细胞内荧光数量的多少取决于其 中的DNA 含量[31]。
1994 年，CINA[32]首次基于FCM分析DNA 降解细胞数与完整细胞数的比值推测PMI。通过FCM 对不同温度条件下死后组织细胞的DNA 进行定量研究发现，相较于其他影响死后DNA 降解的因素，环境温度对DNA降解有重要影响[33-35]。FCM 通过荧光标记进行DNA 检测，能够更好地发现不同组织检材的DNA 含量随着PMI 延长的变化。研究[36]发现，在相同的环境条件下，相对于肋软骨细胞的DNA 降解曲线，随着PMI的延长，人牙髓细胞的DNA 降解曲线在0～4 d 存在一个降解平台期，在应用人牙髓细胞DNA 推断PMI 时，可以此作为参考。另外，机体死亡后，肝、肾、心、脾细胞核DNA 含量随PMI 延长而逐渐减少，具有一定的变化规律[37-39]，其中脾细胞核DNA 含量的变化趋势与PMI 最具相关性。WILLIAMS 等[40]研究了其他器官到肠道的距离与死后DNA 降解量之间的关系，发现尸体脑组织中DNA 降解率较脾组织低，或更适用于FCM 的检测，但在头部创伤、头部枪伤或溺死等情况下，使用脑组织作为评估PMI 的样本将存在局限性。
FCM 具有检测准确、灵敏、可定量的特点，但不适用于已经发生自溶的组织，因DNA 降解[35]会导致结果产生偏差，此外，在操作过程中对DNA 的人为破坏也可能对结果及模型构建产生影响。
1.4 实时荧光定量PCR 技术
实时荧光定量PCR 通过实时检测PCR 每个循环扩增产物的荧光信号对起始模板质量进行定量及定性分析。目标核酸的起始拷贝数越高，观察到荧光的时间也越早[41]。
目前，实时荧光定量PCR 技术在结合DNA 推断PMI 研究中的应用逐渐受到法医学者的广泛关注。研究[42]发现，可通过SD 大鼠死后心血总DNA 含量变化及大肠杆菌LacZ基因浓度变化情况推断早期PMI；
对于晚期PMI 的推断，基于大鼠脑、肝、肾和肌肉样本的研究[43]发现，脑组织适用于腐败尸体的DNA 分析。基于对猪的骨骼肌[44]、人的牙齿[45-46]等的研究提出，时间和环境温度是影响DNA 降解的主要因素。另外，也可运用实时荧光定量PCR 技术检测昆虫的特异性基因来推断PMI[47]。相较于传统PCR技术，实时荧光定量PCR 技术可以更加灵敏和准确地观察到DNA 含量的动态变化，也便于开展结合环境等因素的PMI 相关研究，同时还可以区分原核生物和真核生物的DNA。但实时荧光定量PCR 技术只能检测已知的目标序列，目前应用该技术检测DNA 以实现对PMI 准确推断的相关研究较少。
1.5 高通量测序技术
近年来，随着高通量测序技术的飞速发展，其高准确性、高通量、高灵敏度等优点促使微生物研究进入了第三个黄金时期。与传统微生物分离培养模式不同的是，高通量测序技术可将环境中的全部微生物看作一个整体，对其总的基因组进行监测分析，通过物种注释等对环境微生物的多样性及变化规律开展系统性研究[48]。人体内含有多种细菌，这些细菌在人体死亡后可呈现出种类和丰度的变化，因此，基于高通量测序技术研究机体死后体内菌群的变化规律推断PMI 成为近年来的研究热点。
高通量测序技术可获得高通量的物种丰度、测序信息，为基于微生物的PMI 推断研究提供了新技术手段。在死亡原因为溺死的PMI 研究中，通过菌落变化推断PMI 具有较高的适用性[49-51]。对掩埋的骨骼样本及其所处环境中土壤样本里的微生物进行16S rDNA 测序[52]，也证实了利用菌落变化推断PMI 具有一定的可行性。除了对机体表面微生物群落变化的研究，机体内的微生物由于不受或极少受到外界环境的影响，其变化规律在PMI 推断中更有价值。其中，肠道微生物组成及丰度与PMI 的相关性是重要的研究方向之一[53-55]。研究发现，微生物群落的相似性与PMI（60 d 内）之间存在显著线性关系[56]，结合偏最小二乘法、随机森林等机器学习算法模型研究，可实现更为准确的PMI 推断[55-57]，且通过土壤、直肠和皮肤微生物推断PMI 的预测模型准确率可达80%以上。高通量测序技术在测序过程中需要注意测序深度，避免低深度测序时出现测序错误等问题影响最终结果的准确性[58]，同时需要对数据进行严格质量控制以避免错误[59]。
1.6 其他相关方法
除了上述主流方法外，激光共焦显微拉曼光谱术、由末端脱氧核苷酸转移酶介导的缺口末端标记法（terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTPbiotin nick end labeling assay，TUNEL）[60]技术也应用于基于DNA 变化的PMI 研究中。通过激光共焦显微拉曼光谱技术对置于特定环境中的肾和肝组织进行研究[61-62]，发现人死亡后肾、肝组织细胞DNA 含量随着PMI 延长呈线性下降趋势。而TUNEL 法将脱氧尿苷三磷酸（deoxyuridine triphosphate，dUTP）结合到大鼠肝、肾、脾组织DNA 的3′末端[63]，发现dUTP 的剩余量随PMI 延长而减少，可用于早期PMI 的推测。高效液相色谱-串联质谱法（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）对尸体长骨的皮质骨数据进行分析[64]，发现腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和Ⅰ型胶原多肽等在死后20 年明显减少。此外，基于分光光度计和微芯片电泳技术对凋亡和（或）坏死细胞中的游离DNA 进行分析[65]，发现尸体的游离DNA 浓度明显高于健康人群和心脏病患者，窒息死亡者的血清游离DNA 浓度随PMI 的延长略有升高，并认为血清游离DNA 浓度和片段大小具有推断PMI 和死因的潜力，为后续分析提供了研究思路。
在法医学鉴定工作中，常常会遇到质量不佳的检材，生物大分子多因机体死亡而发生降解。DNA 作为人体中较为稳定的分子，针对其死后变化规律与PMI 的相关研究也较多，发现随着PMI 的延长，体内的DNA 会不断降解，且不同器官组织细胞中的DNA降解程度不同。除了不同组织的影响外，环境条件[43，66]同样会对DNA 降解产生影响。研究[67]表明，在考虑环境变量建立模型时，可提升预测准确度[68]。目前大部分研究主要通过建立相关动物模型[5，42，53-54，57]来检测DNA 降解量，进而进行PMI 推断，然而对于动物模型的准确性，还需后续加以验证。此外，SCGE、计算机图像分析和FCM 等方法需要进一步规范操作流程及质量控制标准，避免人为因素影响实验结果。由于环境条件、组织器官降解情况等因素差异较大，具体的方法和待测组织的选择仍需要根据实际工作中的样本条件及个体差异而决定。
近年来，芯片技术[65]、高通量测序技术[57，69]、宏基因组学测序[56，70]等技术的应用，使得多组学技术研究人体生物大分子以及微生物菌群的变化成为可能，从而获得更为准确的PMI 推断模型，但也需要建立系统的新技术方法体系并验证技术的准确性，提升数据分析能力，以具备高通量数据分析研判的素质。相信随着技术的发展，将基因组学、转录组学、蛋白组学、宏基因组学等新理论与高通量测序技术结合，通过建立机器学习、深度学习和强化学习等新算法模型，能显著推动PMI 推断的研究进展，实现多组学层面的指标筛选以及更精准的推断模型构建，促使PMI 推断技术尽早成熟并应用于实践。
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