司方洁，任金瑶，黄涛祥，俞仪阳，郭坚华，蒋春号
（南京农业大学植物保护学院，南京 210095）
番茄灰霉病是由灰葡萄孢菌Botrytis cinerea引起的一种重要的世界性番茄病害，严重影响番茄果实的产量和品质。该病害造成果实腐烂，也侵染叶、茎和花，造成严重减产，产量损失高达 20%～50%，而且发病后传播速度快，极大的威胁保护地的番茄安全生产[1]。该病害已在全国各地普遍发生，且呈上升趋势，已成为番茄等茄果类蔬菜设施栽培的主要限制因素[2,3]。另外，由于缺少抗病品种，农业防治措施需要大量人力，化学防治易产生抗药性，因此使用芽胞杆菌等生物防治的方式防治灰霉病被认为具有广阔的应用前景。
芽胞杆菌可以在生物表面形成生物被膜继而大量定殖，且生防菌在叶围、根围的定殖能力与其防病能力密切相关[4,5]。芽胞杆菌生物被膜基质的组成成分包括胞外多糖（EPS）、TasA蛋白、γ-多聚谷氨酸（γ-PGA）以及一些脱氧核糖核酸（DNA）等物质。生物被膜的构成骨架和基本组分是通过epsA-O操纵子和tapA-sipW-tasA操纵子合成胞外多糖（EPS）和胞外蛋白TasA，后将其分泌到胞外基质，从而维持芽胞杆菌生物被膜的结构稳定[6]。在芽胞杆菌生物被膜形成调控网络关键因子Spo0A下游的SinR/SinI系统中[6,7]，SinR是一种DNA结合蛋白，可以结合在epsA-O和tapA-sipW-tasA的启动子区域，从而抑制生物被膜的形成[6,7]。sinI位于sinR的下游能够与sinR结合，阻碍sinR与启动子区域结合，进而促进生物被膜的形成。除了 SinR/SinI系统，Spo0A下游还有 AbbA/AbrB系统，AbrB功能与sinR类似，可以抑制epsA-O和tapA-sipW-tasA的表达，从而抑制生物被膜的形成。然而AbbB与AbrB结合成为复合蛋白，能阻碍AbrB与epsA-O和tapA-sipW-tasA的结合，促进生物被膜的表达[8,9]。除了通过大量定殖在叶围、根围表面形成生物被膜从而防治灰霉菌，芽胞杆菌也产生多种具有广泛生物活性的化合物用于防治番茄病害[10,11]，芽胞杆菌能分泌多种抗生素物质，酶类以及一些小肽和蛋白，例如，枯草菌素可以显著防治小麦全蚀病，并且促进小麦的生长，枯草芽胞杆菌分泌的iturin A和fengycin显著抑制黄瓜白粉病[11]。
课题组前期筛选获得的一株贝莱斯芽胞杆菌B.velezensis5YN8，其对于灰霉病具有高拮抗活性，温室试验结果显示，其可以在叶片大量定殖，高效防治灰霉病[10]。众所周知，生防芽胞杆菌的防病效果受到各种防病相关性状的影响，尤其是5YN8在根围、叶围的定殖能力影响生防菌株对番茄病害的生防效果，同时定殖情况对番茄的生长促进非常重要。而生物被膜的形成可以使5YN8在植物叶部高效定殖、持续存在并发挥作用。因此，本文构建不同生物被膜调控系统的突变体，如生物被膜形成相关基因spo0A、epsA-O、tasA、sinl、sinR、abrB[12]（图1），并检测了基本生理生化特性及其防病表型，探究调控贝莱斯芽胞杆菌5YN8生物被膜的形成机制，研究生物被膜形成能力与5YN8定殖量、拮抗效果、防效的相关性，探究5YN8形成生物被膜的能力对于其防治番茄灰霉病的作用。
图1 芽胞杆菌生物被膜形成基因调控系统Fig.1 The gene regulation pathway of biofilm formation in Bacillus sp.
1.1 试验材料
供试番茄品种：合作903（上海市长征良种实验场）。
供试菌株：生防菌株贝莱斯芽胞杆菌B.velezensis5YN8[10]，参试病原菌灰霉菌Botrytis cinereaBC1303，均由南京农业大学生物农药及绿色植保实验室保存。
1.2 生防菌5YN8菌液的制备
贝莱斯芽胞杆菌5YN8保存于-70 ℃超低温冰箱中，利用LB培养基，采用划线法活化菌株，LB（胰蛋白胨10 g/L；
酵母提取物5 g/L；
NaCl 10 g/L，pH调至7.0）培养基上37 ℃，培养1 d。挑取平板上单个菌落接种于5 mL LB试管培养液中，30 ℃、220 r/min培养24 h后制成种子液。后面根据实际需求扩大培养，条件如上所述。
1.3 生防菌5YN8生物被膜形成关键基因突变体的构建
在野生型贝莱斯芽胞杆菌菌株5YN8中构建目的基因突变体采用基因组DNA直接转化方法[13]，提取相应菌株的基因组（表1），挑取过夜培养野生型贝莱斯芽胞杆菌5YN8单菌落至2 mL MC（每升含K2HPO4，14.036 g；
KH2PO4，5.239 g；
葡萄糖20 g；
300 mmol/L柠檬酸三钠，10 mL；
22 mg/mL柠檬酸铁铵，1 mL；
酪蛋白水解物，1 g；
谷氨酸钾2 g，过滤灭菌）培养液中，在37 ℃振荡培养6 h后吸取300 µL入新试管中并加入基因组。继续培养2 h后将培养液涂布于含有相应抗生素的LB 平板上，构建了野生型菌株5YN8的生物被膜形成基因突变体spo0A、epsA-O、tasA、sinl、sinR和abrB。
表1 本研究种涉及到的菌株列表Table 1 The strain information used in this study
提取大肠杆菌中含有的pDG1662质粒，挑取过夜培养野生型贝莱斯芽胞杆菌5YN8单菌落至2 mL MC培养液中，在37 ℃振荡培养6 h后吸取300 µL入新试管中并加入pDG1662质粒。继续培养2 h后将培养液涂布于含有氯霉素的LB 平板上，构建具有氯霉素抗性的菌株5YN8。
1.4 生防菌5YN8及其突变体在番茄叶片上的定殖动态检测
将5YN8及其突变体ΔepsA-O、ΔsinI、Δspo0A、ΔtasA、ΔsinR和ΔabrB培养至OD600值为1.0，将不同的发酵菌液分别喷施于清水清洗过的番茄叶片，分别在接种的第0、2、4、6、8和14 d，将0.2g的叶片在1.8 mL的PBS缓冲液中研磨，研磨后的匀浆稀释涂布于LB平板（5YN8采用氯霉素 5 μg/mL，ΔepsA-O、ΔsinI、Δspo0A、ΔtasA采用壮观霉素50 μg/mL，ΔsinR、ΔabrB采用卡那霉素50 μg/mL），统计菌落数。
1.5 生防菌5YN8及其突变体对番茄灰霉病菌的体外拮抗
采用平板对峙法测定贝莱斯芽胞杆菌5YN8野生株和突变株活体对番茄灰霉病害病原菌的抑菌活性：在28 ℃的恒温摇床中以在200 r/min转速下培养5YN8至OD600值为1.0为5YN8菌液。在距离5 mm的灰霉菌菌碟2.5 cm处分别点置2 μL的上述5YN8的菌液与ΔepsA-O、ΔsinI、Δspo0A、ΔtasA、ΔsinR、ΔabrB突变体，菌丝长至接近满皿时测量抑菌带宽度。
1.6 生防菌5YN8及其突变体对于番茄灰霉病防效测定
取4周大小野生番茄苗，分别用贝莱斯芽胞杆菌5YN8野生型及突变体菌株ΔepsA-O、ΔsinI、Δspo0A、ΔtasA、ΔsinR、ΔabrB、无菌水喷施于番茄叶片表面。3 d后，从3株番茄上剪下共12片叶片，接种直径3 mm灰霉菌碟，将接种灰霉菌的叶片放在湿纸上，置于覆盖透明膜的塑料托盘内置于20 ℃，相对湿度为90%，光周期为12 h（200 μE/m2s）/12 h的光照培养箱中培养。接种2～3 d后用游标卡尺测量病斑大小。
1.7 生防菌5YN8及其突变体固气界面的生物被膜表型检测
吸取5 μL对数生长期菌液点于LBGM（胰蛋白胨10 g/L；
酵母提取物5 g/L；
NaCl 10 g/L，0.1 mmol/L MnSO40.1%，50%甘油2%，pH调至7.0）平板上，通风橱吹干后置于室温培养72 h，以尼康COOLPIX相机拍照记录菌落形态。
1.8 生防菌5YN8及其突变体液气界面的生物被膜表型检测
吸取3 μL对数生长期菌液加入含有3 mL LBGM培养液的6孔细胞培养板中。室温静置培养24 h，采用尼康COOLPIX拍照，记录结果。
1.9 数据统计与分析
利用 IBM SPSS 21 软件 Duncan’s 新复极差法进行统计分析、皮尔逊相关性分析。
2.1 生防菌5YN8及其突变体生物被膜的形成
通过对贝莱斯芽胞杆菌5YN8及其构建的突变体进行生物被膜表型检测，如图2A结果所示，在24 h时，与野生型相比，突变体在生物被膜形成能力上具有显著差异。5YN8在培养24 h后能够形成有空间立体结构且具有褶皱的生物被膜，但在突变体菌株ΔtasA、ΔepsA-O中形成的生物被膜光滑。突变体菌株ΔsinI、Δspo0A形成的生物被膜，与ΔtasA、ΔepsA-O相比，生物量显著增多，但与野生型相比形成的褶皱不显著。突变体菌株ΔsinR、ΔabrB中形成的生物被膜具有复杂的空间结构，并且形成了丰富的褶皱。如图2B显示，在固、气接触面上，72 h后生物被膜增强型中间凹陷，环状突起褶皱显著，外圈的褶皱十分显著。野生型菌株5YN8仅仅出现了内部凹陷，外部的褶皱不显著。突变体菌株ΔsinI、Δspo0A、ΔtasA在培养基表面未形成凹陷，仅中间部分出现褶皱，其中ΔepsA-O甚至未出现褶皱。
图2 菌株5YN8与突变体的生物被膜形成能力比较Fig.2 The Comparison of biofilm formation ability between biocontrol strain 5YN8 and mutants
2.2 生防菌5YN8及其突变体在番茄叶片表面的定殖情况
如图3结果所示，生防菌5YN8的生物被膜形成能力与叶面的定殖能力紧密相关，0 d初始时5YN8定殖量为5.4×106CFU/g，随着时间推移5YN8的定殖量逐渐减少；
第14 d，定殖量为3.9×105CFU/g。5YN8的突变体ΔepsA-O、ΔsinI、Δspo0A的定殖趋势一致，生物被膜减弱型突变体在第8 d会显著下降，最终在叶片的定殖量为6.16×104CFU/g，ΔtasA在第2 d、第6 d定殖量显著降低，最终定殖量为1.2×105CFU/g，生物被膜增强型突变体ΔsinR、ΔabrB初始定殖量在6×106CFU/g，在第2 d开始相比生物被膜减弱型叶围定殖量降低速度缓慢，但ΔabrB在第4 d定殖量会增加，逐渐减少后最终定殖量为1.4×106CFU/g。
图3 菌株5YN8及其突变体在番茄叶片的定殖动态Fig.3 Colonization dynamics of biocontrol strain 5YN8 and its mutants on tomato leaves
2.3 生防菌5YN8及其突变体的抑菌活性检测
为探究生物被膜相关基因的突变对抑菌效果的影响，检测生防菌5YN8及突变体对灰霉病的抑菌效果（图4A）结果表明，5YN8形成生物膜的能力与直接拮抗灰霉病的效果具有一定的相关性。生物被膜增强型的突变体菌株ΔsinR与ΔabrB，其显著增强了对灰霉病菌的直接拮抗效果，并且ΔabrB的直接拮抗效果强于生物被膜增强突变体ΔsinR。同时，生物被膜减弱型的抑菌效果显示，生物被膜减弱型对于灰霉病的拮抗带宽均不同程度发生了减少（图4B）。另外，图4C的结果表明，生物膜相关基因的缺失不影响菌株的生长。通过平板拮抗的抑菌带宽发现，生物被膜减弱型ΔepsA-O、ΔsinI、ΔtasA对于灰霉病原菌的拮抗带宽显著减少，ΔabrB、ΔsinR对于灰霉病原菌的拮抗带宽显著增宽。
图4 菌株5YN8及其突变体对灰霉病菌的抑菌效果Fig.4 The inhibition effect of biocontrol strain 5YN8 and mutants against B.cinerea
2.4 生防菌5YN8及其突变体对于番茄灰霉病的防治效果
为探究生物被膜相关基因的突变对其生防效果的影响，在叶片喷施野生型5YN8及其突变体3 d后，接种灰霉菌碟，探究野生型菌株及其突变体的防治效果。如图5、表2结果表明，对于生物被膜减弱型突变体ΔtasA、ΔsinI、Δspo0A、ΔepsA-O其对于灰霉病的防治效果减弱，防效仅为43.76%、41.45%、16.02%和25.65%。生物被膜增强型ΔabrB与ΔsinR对于灰霉病的防治效果显著增强，防治效果达80.77%、78.94%。结果表明，生物被膜作为定殖的关键一步对于生防菌的防治效果具有重要作用，增强生物被膜形成能力也显著增强了生防菌对灰霉病的防治效果。
图5 菌株5YN8及其突变体在离体叶片上的防治效果Fig.5 The control effect of biocontrol strain 5YN8 and its mutants on detached leaves
表2 菌株5YN8及其突变体对番茄灰霉病的防治效果Table 2 The control effect of biocontrol strain 5YN8 and its mutants on B.cinerea
2.5 皮尔逊相关性分析
对生防菌定殖能力、抑菌带宽与病斑直径（病害严重度）之间的相关性进行分析结果显示，生防菌定殖能力与病斑直径的R=-0.9725，抑菌带宽与病斑直径的R=-0.8708，说明两者之间呈线性相关。从图 6可以看出，生防菌定殖能力与病斑直径（病害严重度）之间呈负相关，生防菌定殖能力越强，病斑直径越小；
抑菌带宽与病斑直径同样呈负相关，抑菌带宽越宽，病斑直径越小。
图6 定殖量与防病效果的相关性Fig.6 The correlation between the amount of colonization and the control efficacy
本试验探究生物被膜形成能力与防病能力的相关性，充分挖掘生防菌防治灰霉病的影响因素。通过构建5YN8背景下生物被膜增强型突变体ΔabrB、ΔsinR及生物被膜减弱型突变体Δspo0A、ΔsinI、ΔepsA-O、ΔtasA，观察不同的的突变体在液气表面、固气表面形成生物被膜及在叶面的定殖能力，不同突变体表型研究结果表明5YN8生物被膜的形成依赖epsA-O、sinI、spo0A、tasA、sinR、abrB基因的调控，同时生物被膜增强型ΔsinR、ΔabrB在叶片的最终定殖量相比野生型显著增多，定殖量减少速度相比野生型显著降低，最终的定殖量稳定在1.4×106CFU/g。生物被膜减弱型ΔtasA、ΔepsA-O、ΔsinI、Δspo0A其在叶面的定殖量就显著少于野生型,最终在叶面的稳定定殖量只有6.16×104CFU/g。表明生物被膜与5YN8在叶片的定殖能力具有正相关性。图6的相关性分析表明，防病效果与定殖量具有显著相关性，随着定殖量增加，5YN8的防病效果也显著增加了。微生物在植物根部的定殖是根际细菌对植物发挥有益作用能力的关键步骤，在实验室条件下，很多研究都表明芽胞杆菌形成生物被膜的能力与其在根际和叶围的定殖能力紧密相关，成为芽胞杆菌防病的第一步。解淀粉芽胞杆菌、贝莱斯芽胞杆菌、枯草芽胞杆菌的定殖能力主要取决于它们形成生物被膜的能力[20]。Chen等[21]研究发现枯草芽胞杆菌在番茄根部形成生物被膜从而定殖，Bais等[22]证实构建的野生型芽胞杆菌B.subtilis6051的生物被膜减弱型突变体的根际定殖能力与野生型相比显著下降。
生物被膜除了直接影响生防菌在叶围和根围的定殖，国内外大量研究表明枯草芽胞杆菌、贝莱斯芽胞干菌生成生物被膜模式对细菌防病起着至关重要的作用[8,20]。试验发现，在叶围定殖量增加的生物被膜增强型显著提高了贝莱斯芽胞杆菌 5YN8的防病效果，生物被膜增强型ΔsinR、ΔabrB其防治效果都达到了78.94%、80.77%，5YN8的突变体Δspo0A、ΔepsA-O的抑菌率显著下降了，对于灰霉的防效分别为16.02%，25.06%。不同的突变体平板拮抗效果也显示出，5YN8生物被膜增强型ΔabrB与ΔsinR对于灰霉病的平板拮抗效果显示，抑菌带宽显著增强，据图6通过相关性分析发现，防病效果与抑菌带宽成显著的正相关性，首次发现贝莱斯芽胞杆菌5YN8抑制灰霉菌的生长与生物被膜的形成具有相关性。在枯草芽胞杆菌中已发现生物被膜的形成与其抗生类物质的合成相关，生物被膜缺失型的脂肽类抗生素surfactin分泌减少，而脂肽类抗生素surfactin是芽胞杆菌重要的抗菌活性因素[16]。据报道，在枯草芽胞杆菌中也发现生物被膜缺失型分泌的surfactin减少，对于PstDC3000的防病效果显著下降的现象[5,22]。在贝莱斯芽胞杆菌5YN8中一方面生物被膜的形成可能促进了细菌的生长以及生物量的积累，有研究发现，Δspo0A的缺失突变体菌株胞外蛋白分泌量显著减少[23]。另一方面，前期研究发现，5YN8通过VOCs途径抑制灰霉菌的生长[10]，生物被膜调控相关基因可能对VOC的合成存在直接或间接的调控作用，从而影响菌株的拮抗能力。本研究结果显示贝莱斯芽胞杆菌的生物被膜形成依赖epsA-O、sinI、spo0A、tasA、sinR、abrB基因的调控，并且生物被膜的形成与贝莱斯芽胞杆菌防治灰霉病具有相关性，为后续在生物被膜与防治灰霉的关系上，对生防菌5YN8防治番茄灰霉病的防治机理的研究，以及生防芽胞杆菌防治灰霉病的功能修饰增强及田间高效应用提供理论依据。
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