张 鄂 黄 畅 费永光 岑瑞祥 陈 沛 （武汉市第一医院耳鼻咽喉头颈外科，武汉 430022）
喉癌是头颈部癌中较为常见的恶性肿瘤类型，具有较高的发病率和病死率。喉鳞状细胞癌（laryngeal squamous cell carcinoma，LSCC）是喉癌中最常见的组织病理学类型，约占喉癌病例的85%～95%，据统计，全球每年约能诊断出110 000例LSCC新发病例，其中有40%已处于癌症晚期［1-2］。LSCC的主要治疗方法仍是手术切除，然而部分晚期LSCC由于发生了远处转移而无法进行手术根治。对于这些转移且难以切除的LSCC病例，放射治疗在局部控制中发挥关键作用［3］。但LSCC患者在放射治疗过程中往往产生放射抗拒，导致患者预后较差，五年总生存率仍然较低。因此，有必要对LSCC放射抗拒发生发展中的调控机制进行深入了解，以选择有效的治疗靶标，提高肿瘤细胞的放射敏感性。
鞘糖脂微结构域1相关磷酸化蛋白（phosphoprotein associated with glycosphingolipid microdomains 1，PAG1）是一种跨膜衔接蛋白，位于细胞膜脂筏。PAG1在抗原运输和免疫信号传导中具有重要作用，其表达水平的增加可能具有促炎作用［4-5］。既往研究表明，PAG1在肿瘤中发挥的作用取决于其表达水平，此外，在喉癌原发性放射抗拒表型中具有关键调控作用［6］。鉴于此，本研究通过检测LSCC组织中PAG1的表达水平，并将PAG1-siRNA转染至肿瘤相关巨噬细胞，建立肿瘤相关巨噬细胞与放射抗拒人喉鳞癌细胞共培养体系，探究PAG1在介导肿瘤相关巨噬细胞对放射抗拒人喉鳞癌细胞的作用及相关机制，为开发有效的克服LSCC放射抗拒基因治疗措施奠定实验基础。
1.1 材料
1.1.1 临床样本 收集2018年1月至2020年6月于武汉市第一医院接受手术切除的LSCC患者40例的肿瘤组织及邻近癌旁组织（距肿瘤边缘≥5 mm）。其中男性24例，女性16例，年龄43～71岁，平均年龄（48.90±5.12）岁，所有患者均为原发病例，临床资料完整，且手术前未接受放化治疗。病理切片由 2名经验丰富的病理医师复查判定。在手术中取材的新鲜标本立即于液氮中冷冻，置于-80 ℃冰箱保存。所有对象均签署知情同意书，该研究方案在武汉市第一医院伦理委员会的监督下获得批准和实施。
1.1.2 主要材料与试剂 人喉鳞癌细胞株Hep-2和人外周血单核细胞系THP-1购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，放射抗拒人喉鳞癌细胞株Hep-2max由武汉市第一医院耳鼻咽喉头颈外科构建保存；
免疫组织化学染色试剂购自上海昊鑫生物公司；
Trizol试剂和Lipofectamine2000细胞转染试剂盒购自美国Invitrogen公司；
cDNA反转录试剂盒和SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒购自日本TaKaRa公司；
PMA和IL-4购自美国Sigma公司；
IL-6、IL-12、IL-4及IL-10 ELISA试剂盒购自南京凯基生物公司；
Transwell小室购自杭州四季青生物公司；
MTT试剂液和免疫荧光染色试剂购自上海碧云天生物研究所；
Annexin V-FITC/PI和TUNEL细胞凋亡检测试剂盒购自武汉博士德生物公司；
兔抗人CD86-PE和CD206-FITC抗体购自eBioscience公司；
兔抗人PAG1、Beclin-1、LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ及P62购自英国Abcam公司；
辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔IgG和FITC标记的山羊抗兔IgG购自美国Cell Signaling公司。PAG1-siRNA（5"-GCAGAGAUAUUACCAGGCUdTdT-3"）及阴性对照序列（5"-UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT-3"）参考文献［7］设计，交由上海生工生物公司合成。
1.2 方法
1.2.1 免疫组织化学染色检测LSCC组织中PAG1表达 将LSCC组织及癌旁组织置于4%多聚甲醛中固定24 h，经梯度乙醇脱水和二甲苯透明后，常规石蜡包埋，制备厚度为4 μm的连续切片。切片脱蜡脱水，加入枸橼酸缓冲液煮沸10 min，冷却，PBS清洗，然后将切片置于3%H2O2溶液消除内源性过氧化物酶，PBS清洗，滴加山羊血清封闭液，室温封闭 30 min，滴加稀释的兔抗人PAG1（1∶200），4 ℃下孵育过夜。次日，PBS清洗，滴加稀释的HRP标记的山羊抗兔IgG（1∶1 000），室温继续孵育30 min，PBS再次清洗，滴加二氨基联苯胺（DAB）显色，采用苏木素复染15 s，流水反复冲洗，脱水透明，中性树胶封片，干燥，通过光学显微镜观察组织切片并拍照。PAG1阳性表达以棕色颗粒为主，电镜下随机选择 5个视野，以阳性细胞结合染色强度进行综合评定。阳性细胞评分：阳性细胞比例＜5%记0分，5%～25%记1分，26%～50%记2分，51%～75%记3分，＞75%记4分。染色强度评分：未着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。两者相加分数＜2分则判定为阴性，≥2分判定为阳性。
1.2.2 实时荧光定量PCR检测PAG1 mRNA表达 在剪碎的组织或细胞中加入Trizol试剂提取总RNA，紫外分光光度计检测RNA纯度与浓度，选择OD260/OD280范围在1.8～2.0之间的样品。根据反转录试剂盒说明书操作，将总RNA逆转录合成cDNA，RT-qPCR检测基因表达，以cDNA为模板，采用SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒进行实验，GAPDH作为内参基因。扩增条件如下：95 ℃ 3 min，1个循环；
95 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、58 ℃ 30 s，40个循环，根据2-ΔΔCt法计算基因mRNA相对表达量。引物交由上海生工生物公司合成，PAG1正向引物：5"-GCAGCGGACAGATGCAGAT-3"，反向引物：5"-CAGGAAGATGAGGAAGGTGATGA-3"；
GAPDH正向引物：5"-AACGGATTTGGTCGTATTG-3"，反 向 引 物：5"-GGAAGATGGTGATGGGATT-3"。
1.2.3 肿瘤相关巨噬细胞的诱导与鉴定 取生长状态良好的THP-1细胞，调整密度为1×106个/ml，吸取100 μl接种于6孔板，参考文献［8］方法诱导，加入含50 ng/ml PMA的培养基诱导24 h后，弃培养液，PBS清洗细胞；
再加入含20 ng/ml IL-4的培养基诱导72 h，使细胞分化为M2型肿瘤相关巨噬细胞，以未诱导的THP-1细胞作为对照组。参考文献［9］方法，根据细胞是否贴壁，胞体是否出现伪足以及M2型巨噬细胞生物指标CD206是否上调判断诱导是否成功。收集诱导后的细胞，PBS洗涤并重悬，在细胞悬液中加入等体积血清，室温下封闭30 min，加入兔抗人CD86-PE抗体和兔抗人CD206-FITC抗体，4 ℃下暗室孵育30 min，PBS洗涤细胞，并再次重悬细胞，流式细胞仪检测细胞表面巨噬细胞标记物的表达情况。
1.2.4 PAG1-siRNA转染肿瘤相关巨噬细胞 取诱导后的肿瘤相关巨噬细胞，调整密度为1×106个/ml，吸取100 μl接种于96孔板，37 ℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱过夜培养。将细胞随机分为3组，包括对照组、阴性对照组（NC-siRNA）、PAG1-siRNA组，按照Lipofectamine2000转染试剂说明书操作，配制PAG1-siRNA及阴性对照NC-siRNA与脂质体Lipofectamine2000复合物，在对应分组细胞中加入复合物进行转染，37 ℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养4～6 h，弃培养液，换用新鲜培养液继续培养48 h，RT-qPCR和Western blot检测细胞转染效果。
1.2.5 Western blot检测PAG1与自噬相关蛋白表达 在各处理组细胞中加入预冷的RIPA裂解液，置于冰上裂解，离心取上清液，根据BCA试剂盒说明测定蛋白浓度。各组蛋白样品均以30 μg进行上样，通过10%SDS-PAGE电泳分离，将分离后的蛋白电转至PVDF膜。TBST洗膜，并置于5%山羊血清中封闭2 h，再次洗膜后，加入稀释的兔抗人PAG1 （1∶1 000）、Beclin-1（1∶1 000）、LC3-Ⅱ（1∶1 000）、
LC3-I（1∶1 000）及P62（1∶1 000）抗体，4 ℃下孵育过夜。次日，TBST洗膜，加入稀释的HRP标记的山羊抗兔IgG（1∶5 000）抗体，室温继续孵育2 h。TBST洗膜，滴加ECL化学发光试剂液显影，凝胶成像系统观察各蛋白条带，Image J图像分析软件统计各条带灰度值，以GAPDH为内参计算各目的蛋白表达水平。
1.2.6 ELISA检测单核细胞分泌相关细胞因子表达变化 收集转染48 h后各处理组肿瘤相关巨噬细胞培养上清液，按照ELISA试剂盒说明书操作，检测巨噬细胞分泌相关细胞因子IL-6、IL-12、IL-4及IL-10含量。酶标仪测定各反应孔在450 nm处的吸光度值（A），制作标准曲线，计算各孔中对应各项细胞因子水平。
1.2.7 细胞共培养系统的建立与放射处理 以孔径为0.4 μm的Transwell小室和24孔细胞培养板建立Transwell共培养系统，在上室接种处于对数期的Hep-2max细胞1×105个，下室接种不同处理组的肿瘤相关巨噬细胞2×105个。根据下室接种的细胞类型，分组包括：Hep-2max组（下室为正常培养基）、M2+Hep-2max组（下室为诱导后的肿瘤相关巨噬细胞）、PAG1-siRNA-M2+Hep-2max组（下室为PAG1-siRNA转染的诱导后的肿瘤相关巨噬细胞）。将Transwell共培养系统置于37 ℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中连续培养4 d，收集上室Hep-2max细胞。采用8 Gy X射线照射Hep-2max细胞24 h，1 000 r/min离心5 min，收集细胞。此处以未经8 Gy X射线照射的Hep-2max细胞作为对照组。
1.2.8 MTT法检测细胞活性 调整各处理组Hep-2max细胞浓度，以2×104个/孔接种至96孔板，置于37 ℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养，分别在培养24 h、48 h及72 h时，在每孔中加入20 μl MTT （5 mg/ml）试剂，继续孵育4 h，弃培养液，每孔加入150 μl DMSO试剂，置于摇床振荡至蓝紫色结晶甲瓒完全溶解，酶标仪测定各反应孔在490 nm处的吸光值（A）。
1.2.9 流式细胞术检测细胞凋亡 PBS洗涤各处理组Hep-2max细胞，以1 000 r/min离心3 min，弃上清液，加入适量1×binding buffer重悬细胞，调整密度为1×106个/ml，取100 μl细胞悬液，依次加入5 μl Annexin V/FITC混匀，室温避光孵育5 min，再加入10 μl碘化丙啶（PI），混匀后室温避光孵育10 min，流式细胞仪检测细胞凋亡情况。
1.2.10 TUNEL染色检测细胞凋亡 采用PBS洗涤各处理组Hep-2max细胞，加入4%多聚甲醛，固定细胞30 min，加入含0.3%Triton X-100的PBS重悬细胞，室温避光孵育5 min，然后加入TUNEL检测液，反复吹打至混匀，置于37 ℃下避光孵育1 h，PBS洗涤细胞，经涂片处理，在荧光显微镜下随机选择 5个视野观察，计视野下细胞总数目和TUNEL阳性染色细胞数目，计算TUNEL阳性率。
1.2.11 免疫荧光染色检测细胞自噬水平 采用PBS洗涤各处理组Hep-2max细胞，加入4%多聚甲醛固定细胞15 min，加入含0.5%TritonX-100的PBS液通透处理15 min，PBS洗涤细胞，采用10%山羊血清封闭细胞2 h，加入稀释的兔抗人LC3（1∶200）抗体，4 ℃孵育过夜。次日PBS洗涤细胞，滴加荧光素FITC标记的山羊抗兔IgG（1∶250）抗体，室温避光孵育1 h，滴加DAPI试剂，避光孵育5 min进行染核，PBS洗涤细胞，涂片处理，在荧光显微镜下随机选择5个视野观察，观察蛋白荧光表达强度并拍照。
1.3 统计学分析 SPSS23.0统计学软件进行实验数据分析，Graphpad Prsim 8制作统计图，计量资料采用xˉ±s表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。
2.1 LSCC组织及癌旁组织中PAG1表达比较 通过免疫组织化学染色观察到癌旁组织染色较浅，PAG1阳性表达率为7.50%（3/40），而LSCC肿瘤组织中可见明显棕黄色至褐色的染色，PAG1阳性表达率达97.50%（39/40），阳性表达率较癌旁组织明显增加，差异具有统计学意义（P＜0.01），见图1A。RT-qPCR检测结果显示，LSCC肿瘤组织中PAG1 mRNA相对表达量高于癌旁组织，差异有统计学意义（P＜0.01），见图1B。
图1 喉鳞癌组织及癌旁组织中PAG1表达检测Fig.1 Detection of PAG1 expression in LSCC tissues and adjacent tissues
2.2 肿瘤相关巨噬细胞形态与标志物表达检测 倒置相差显微镜观察诱导前后细胞的形态变化，可见诱导前THP-1细胞边缘清晰，呈规则的圆形或类圆形，而诱导后的细胞形态发生明显改变，呈不规则多边形，胞体有尾足伸出，见图2A。流式细胞术检测结果显示，实验组细胞中M1巨噬细胞表面标记物CD86表达较对照组明显减少，M2型巨噬细胞表面标志物CD206表达较对照组则明显增多，差异有统计学意义（P＜0.01），见图2B。
图2 肿瘤相关巨噬细胞的鉴定Fig.2 Identification of tumor-associated macrophages
2.3 转染后肿瘤相关巨噬细胞中PAG1表达检测 RT-qPCR和Western blot检测结果显示，与对照组相比，PAG1-siRNA组肿瘤相关巨噬细胞中PAG1 mRNA和蛋白相对表达量均显著降低（P＜0.01），而NC-siRNA组细胞中PAG1 mRNA和蛋白相对表达量与对照组相比差异均无统计学意义（P＞0.05），见图3。
图3 转染后各组肿瘤相关巨噬细胞中PAG1表达检测Fig.3 Detection of PAG1 expression in tumor-associated macrophages of each group after transfection
2.4 转染后肿瘤相关巨噬细胞上清细胞因子表达比较 ELISA检测结果显示，PAG1-siRNA组肿瘤相关巨噬细胞上清中IL-6、IL-12水平较对照组升高，IL-4和IL-10水平较对照组降低，差异有统计学意义（P＜0.01）；
NC-siRNA组与对照组中上述细胞因子水平变化差异均无统计学意义（P＞0.05），见图4。
图4 转染后各组肿瘤相关巨噬细胞中上清细胞因子表达检测Fig.4 Detection of cytokine expression in supernatant of each group of tumor-associated macrophages after transfection
2.5 各处理组Hep-2max细胞活性比较 MTT检测结果显示，与对照组相比，8 Gy X射线照射的Hep-2max细胞活性降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；
与诱导后肿瘤相关巨噬细胞共培养再经8 Gy X射线照射的细胞相比，诱导后肿瘤相关巨噬细胞转染PAG1-siRNA与Hep-2max共培养后，再经8 Gy X射线照射，细胞活性下降，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。
表1 各组Hep-2max细胞OD值比较（±s）Tab.1 Comparison of OD value of Hep-2max cells in each group （±s）
表1 各组Hep-2max细胞OD值比较（±s）Tab.1 Comparison of OD value of Hep-2max cells in each group （±s）
Note：Compared with control group， 1） P＜0.05；
compared with M2+Hep-2max， 2）P＜0.05.
2.6 各处理组Hep-2max细胞凋亡情况比较 流式细胞术检测结果显示，经8 Gy X射线照射的Hep-2max细胞凋亡率较对照组明显升高，差异有统计学意义（P＜0.01）；
与Hep-2max细胞和诱导后肿瘤相关巨噬细胞共培养后再经8 Gy X射线照射的细胞相比，Hep-2max细胞和诱导后肿瘤相关巨噬细胞转染PAG1-siRNA共培养后再经8 Gy X射线照射的细胞凋亡率升高，差异有统计学意义（P＜0.01），见图5。TUNEL染色结果显示，与对照组相比，经过 8 Gy X射线照射的Hep-2max细胞TUNEL阳性率升高，差异具有统计学意义（P＜0.01）；
与Hep-2max细胞和诱导后肿瘤相关巨噬细胞共培养后再经8 Gy X射线照射的细胞相比，诱导后肿瘤相关巨噬细胞转染PAG1-siRNA共培养后再经过8 Gy X射线照射的细胞TUNEL阳性率升高，差异具有统计学意义 （P＜0.01），见图6。
图5 流式细胞术检测各处理组Hep-2max细胞凋亡Fig.5 Flow cytometry detection of Hep-2max cell apoptosis in each treatment group
图6 TUNEL染色检测各处理组Hep-2max细胞凋亡（×100）Fig.6 TUNEL staining to detect Hep-2max cell apoptosis in each treatment group （×100）
2.7 各处理组Hep-2max细胞自噬水平比较 通过免疫荧光染色观察细胞自噬情况，可见未经处理的对照组Hep-2max细胞中绿色荧光强，LC3表达水平高；
经8 Gy X射线照射的细胞中绿色荧光强度较对照组明显减弱，LC3表达水平降低；
与诱导后肿瘤相关巨噬细胞共培养后再经8 Gy X射线照射的细胞中绿色荧光强度稍暗，LC3表达水平较高；
而与诱导后肿瘤相关巨噬细胞转染PAG1-siRNA共培养后再经8 Gy X射线照射的细胞中绿色荧光强度明显减弱，LC3表达水平降低，见图7。Western blot检测自噬相关蛋白表达结果显示，与对照组相比，经8 Gy X射线照射的Hep-2max细胞中Beclin-1蛋白表达水平降低，P62蛋白表达水平升高，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ降低，差异有统计学意义（P＜0.01）；
与诱导后肿瘤相关巨噬细胞共培养后再经8 Gy X射线照射的细胞相比，Hep-2max细胞和诱导后肿瘤相关巨噬细胞转染PAG1-siRNA共培养再经 8Gy X射线照射后细胞中Beclin-1蛋白表达水平降低，P62蛋白表达水平升高，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ降低，差异有统计学意义（P＜0.01），见图8。
图7 免疫荧光染色检测各处理组Hep-2max细胞自噬（×400）Fig.7 Immunofluorescence staining to detect autophagy of Hep-2max cells in each treatment group （×400）
图8 Western blot检测各处理组Hep-2max细胞自噬相关蛋白表达Fig.8 Western blot detection of autophagy-related protein expression in Hep-2max cells in each treatment group
LSCC是仅次于肺癌的第二大上呼吸道恶性肿瘤，在世界范围内，种族、国家、年龄及性别之间的差异造成了LSCC在各地区与各国家间的不同发病率［10］。尽管近年来包括外科手术、放射疗法和化学疗法在内的多式联运疗法已有所改善，但患者预后仍不理想。目前，LSCC的复杂病理机制尚不明确，吸烟、饮酒、空气污染和HPV等因素是导致该疾病的主要诱因［2，11］。在临床实践中，LSCC的短期或长期预后取决于其临床阶段，包括远处转移、原发肿瘤大小和淋巴结受累。由于疾病的不同阶段具有各自的特征，仅靠分期不足以预测LSCC的预后和复发风险。因此，阐明LSCC发生发展的重要分子发病机制，鉴别关键的作用因子，对探讨LSCC的治疗策略意义重大。
PAG1也称Csk结合蛋白，作为一种普遍表达的跨膜蛋白，充当Src家族激酶（SFK）的重要调节剂。PAG1在各种恶性肿瘤的发生发展中发挥重要作用，但其表达水平在不同类型癌细胞中是可变的。PAG1表达的增加或减少反映了其在肿瘤细胞中的两种不同途径和功能，即具有促癌作用或抗癌作用。在某些癌细胞中，PAG1表达的下调通过MAPK/PI3K途径的表观遗传组蛋白修饰和二恶英受体AhR的转录抑制来解释，而PAG1表达的上调可能取决于PAG-Lyn信号体的形成以及与EBP50的相互作用［7，12］。本研究发现PAG1在LSCC组织中过表达，但在非肿瘤组织中表达水平较低，推测PAG1可能参与LSCC的病理过程。此外，LIN等［13］研究发现PAG1在鼻咽癌组织和细胞中表达上调，通过靶向PTEN刺激鼻咽癌的增殖与转移能力，从而加重鼻咽癌的恶性进程，进一步实验表明了敲低PAG1可阻止鼻咽癌细胞的增殖、迁移和侵袭；
LU等［14］报道指出PAG1在乳腺癌中高表达，并通过激活Src促进乳腺癌细胞的增殖与转移。由此可见，肿瘤组织中高表达的PAG1可能是潜在的致癌因子。
肿瘤相关巨噬细胞是肿瘤微环境的重要组成部分，通过多种机制参与肿瘤细胞活化、肿瘤血管生成和转移等过程。肿瘤为逃避巨噬细胞的杀伤作用能够使肿瘤相关巨噬细胞表型发生改变，从而促进肿瘤发展进程［15］。目前，一些研究证据表明肿瘤相关巨噬细胞在癌症的放化疗抗性中可能发挥重要作用。ZHENG等［16］最新研究指出在化学疗法刺激下使得更多肿瘤相关巨噬细胞被募集到结直肠癌肿瘤组织中，这与化学抗药性的发展高度相关，而由肿瘤相关巨噬细胞产生的高水平表达的GDF15通过增强脂肪酸β氧化过程从而破坏肿瘤细胞的化学敏感性；
ZHENG等［17］研究发现肿瘤相关巨噬细胞来源的miR-21参与介导胃癌细胞对顺铂的耐药性，miR-21可直接从肿瘤相关巨噬细胞转移到胃癌细胞，通过下调PTEN增强PI3K/AKT信号通路激活，促进胃癌细胞耐药性产生并抑制细胞凋亡；
HUANG等［18］研究发现顺铂耐药的肺癌细胞不仅显示出较强的自我更新能力，还通过分泌巨噬细胞抑制因子促进肿瘤相关巨噬细胞向M2型的极化，并发现这一现象与Src相关信号增加有关。以上研究均提示肿瘤相关巨噬细胞可能与肿瘤细胞耐药性密切相关。同样，本研究结果显示，干扰PAG1表达的肿瘤相关巨噬细胞能够增加放射抗拒人喉鳞癌细胞Hep-2max的放射敏感性，促进Hep-2max细胞凋亡发生。
自噬是一种高度保守的机制，是细胞内蛋白质质量控 制系统的主要组成部分之一，可去除受损细胞器以维持细胞稳态。自噬与细胞凋亡间既有协同作用也有拮抗作用，两者参与了肿瘤细胞化学抗性的稳态［19-20］。研究表明，肿瘤相关巨噬细胞自噬状态的改变可能对肿瘤细胞的放化疗敏感性产生重要影响。APEL等［21］研究发现在下调肿瘤细胞自噬水平后，原本放射抵抗的大肠癌细胞放射敏感性明显增加；
SHAO等［22］研究结果表明结直肠癌细胞的放射敏感性与肿瘤相关巨噬细胞自噬有关，肿瘤相关巨噬细胞中自噬的上调可抑制结肠癌细胞增殖并诱导细胞凋亡，增加结直肠癌细胞的放射敏感性；
GUO等［23］研究结果指出通过氯喹抑制自噬能够改变肿瘤相关巨噬细胞状态，重新极化的M1型巨噬细胞显示出对Hep-2细胞较高的吞噬活性，增加了Hep-2细胞对顺铂的敏感性。本研究发现，干扰PAG1表达的肿瘤相关巨噬细胞与放射抗拒人喉鳞癌细胞Hep-2max共培养后，细胞中LC3绿色荧光强度明显减弱，同时，Beclin-1蛋白表达水平降低、P62蛋白表达水平升高，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ下调，说明细胞自噬状态受到抑制。
综上所述，干扰PAG1能够抑制肿瘤相关巨噬细胞自噬水平，增加与之共培养的放射抗拒人喉鳞癌细胞的放射敏感性。因此推测肿瘤微环境中肿瘤相关巨噬细胞自噬的调节状态可能是肿瘤放射抵抗的机制之一。本研究为提高肿瘤放疗效果的研究提供新思路，该作用涉及的详细机制值得进一步深入研究。
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