夏 英，李婕婷，唐 婧，唐 明，张习敏
(1贵州师范大学贵州省植物生理与发育调控重点实验室，贵阳550025；
2 贵州师范大学西南喀斯特山地生物多样性保护国家林业和草原局重点实验室，贵阳550025；
3 贵州省高等学校高山杜鹃病虫害绿色防控重点实验室，贵阳550025；
4 贵州师范大学 生命科学学院，贵阳550025)
世界气象组织在《2019年全球气候状况声明》报告，2019年全球平均温度比工业化前高出1.1 ℃[1]，并且未来全球将会持续变暖[2]。随着全球气候变暖，引发的极端干旱事件在全球范围内广泛分布[3]，干旱对森林、农业、社会经济等造成较大损失。据统计，在各种自然灾害中，气象灾害造成的经济损失约占70%以上，其中干旱灾害占到50%左右[4]。
中国是世界上植物资源最为丰富的国家之一，观赏植物物种多样，每年都有大量花卉植物由中国传到世界各地[5]。随着人们生活水平的提高，花卉产业已经逐渐成为最具活力的第三产业之一。据统计，2016年中国的花卉生产总面积就达133.04万hm2，比2015年增长了1.91%[6]。花卉植物在现代社会中应用广泛，如园林造景、城市绿化、室内观赏等。由于全球气候变化引发的自然干旱对植物生长发育产生严重影响[7]，在水资源短缺的情况下选择抗旱强的花卉植物是未来必须考虑的问题。
近年来，干旱诱导植物死亡的机制备受关注。其中，干旱引起木质部栓塞是制约植物存活、生长发育的重要因素之一[8-9]。栓塞脆弱性可以反映木质部栓塞大小，同时它与植物的抗旱存在正相关性，栓塞脆弱性越大，植物越不耐旱，反之亦然。因此，通过分析木质部栓塞脆弱性从而评估植物的耐旱性，已在枝条和叶片中广泛报道[10-15]。花是被子植物繁殖、进化和多样性的重要器官[16-17]，也是观赏植物的经济价值所在，目前其栓塞脆弱性的研究报道相对较少[18-19]。
西洋杜鹃(Rhododendronhybridum)花色较多、花型丰富，是中国重要的园林花卉和室内装饰花卉，常见于巷道、庭院、城市绿化[20]。山茶(Camelliajaponica)花期较长，花色、花形丰富，宜盆栽装点景色，常用来美化居室，布置厅堂、会场等，也是一种常见的城市绿化植物。然而，这两种植物的抗旱性并不清楚，本研究利用光学技术构建花瓣和叶片的栓塞脆弱性曲线，并比较它们的栓塞脆弱性大小，为筛选抗旱性花卉植物提供科学依据。
1.1 植物材料
参试植物为塑料盆(盆高13.5 cm，直径14 cm)栽的山茶(Camelliajaponica)和西洋杜鹃(Rhododendronhybridum)，于2021年12月购置于贵州省黔南州惠水县花卉基地(两种植物均带花苞)，培养于贵州师范大学植物生理与发育调控重点实验室温室内(光周期12 h，温度22 ℃，光照强度350 μmol·m-2·s-1，相对湿度60%～70%)。西洋杜鹃和山茶分别培养至2022年1月和2022年3月时开始开花，待部分花朵完全开放后(图1)，立即开始进行干旱处理。
图1 山茶(A)和西洋杜鹃(B)Fig.1 C. japonica (A) and R. hybridum (B)
1.2 山茶和西洋杜鹃抗旱性测定
为了比较山茶和西洋杜鹃的抗旱性，首先对两种植物进行抗旱性测定。干旱处理前先使土壤水分含量达到饱和，然后对盆栽的山茶和西洋杜鹃进行自然干旱处理，以正常浇水为对照。之后每隔3 d用露点水势仪测量实验植物的花瓣、叶片和土壤的水势，共计持续干旱处理12 d，测量时间在上午8:00～11:30间完成。每个处理设置3个重复，每个重复3盆植株。
1.3 花瓣和叶片的光学栓塞脆弱性曲线构建
参考Brodribb 等[12]的光学技术方法并略有修改，在正常浇水的3盆植株上，将带有叶片和花瓣的枝条剪下(约10 cm)，立即插入盛有水的烧杯中使枝条吸水至饱和(水化)，防止测量之前由于脱水而产生的空穴化。水化后将叶片(枝条顶端往下第5片)或花瓣放置在立体显微镜(XTL-6745TJ4-T1000,Suzhou Beitega Optoelectronic Technology Company Limited,China)的载物台上，并用透明胶带将组织固定，防止脱水后卷曲。光从目标组织下方均匀照射，以产生透射光图像，设置显微镜上的相机对组织进行自动拍照，每60 s捕获1张图像，直到观察到叶片或花瓣褐变。在此期间，将正常浇水植株的另外枝条剪下进行自然干旱，然后取枝条顶端往下第5～8片叶片或花瓣，采用露点水势仪(Gene Company Limited,WP4-T,USA)测量它们的水势。
通过使用ImageJ(National Institute of Health,New York,NY,USA)软件中的图像减法对干旱过程中捕获的图像序列进行分析，从而识别和量化栓塞事件。将连续的图像之间进行相减产生一组差异图像，这些图像的相同区域会产生一个黑色的背景，而变化区域会突出为白色(包括栓塞、光的不稳定、叶片卷曲、虫子运动等事件)。然后调节阈值，手动去除与空化事件无关的“噪音”，产生图像堆栈，仅包含栓塞事件相关的像素。测量这些图像堆栈，从而确定每个图像中栓塞像素的总数。计算堆栈中累积的总像素数(计为100%的栓塞)，每张图像中的总像素数占总像素数的百分比即为导管栓塞百分数。再利用导管栓塞百分数和水势进行S型函数拟合，获得栓塞脆弱性曲线。最后，为了可视化栓塞在叶片或花瓣上扩散的动态，根据栓塞事件出现的时间在连续的图像上着色[21]。
1.4 形态特征测量
在干旱处理当天，取正常浇水植株枝条顶端往下第5～8叶片，剪切面积约0.5 cm×0.5 cm的成熟叶片和花瓣，制成石蜡切片并在显微镜下拍照，用Image J图像分析软件测量花瓣和叶片的厚度、上表皮和下表皮厚度、叶片的栅栏组织和海绵组织厚度[22]。叶脉密度测定参照Roddy 等的方法[23]，将花瓣和叶片脱色至透明，然后置于显微镜下拍照，用Image J软件计算叶脉密度(选取范围内叶脉的长度之和/选取的面积)。气孔密度测定参照宋艳波等方法[24]，在叶片背面涂上薄薄一层透明的指甲油，静置30 min，待指甲油自然晾干后用镊子轻轻撕取油膜，油膜放在载玻片上置于显微镜下观察，记录气孔数量，计算气孔密度(气孔数量/视野面积)。
1.5 组织含水量和干物质含量测定
干旱处理当天，取正常浇水植株枝条顶端往下第5～8叶片，用直径为8 mm的打孔器，在花瓣或叶片上取20片圆片，立即称量鲜重，然后将样品放入已升温至105 ℃烘箱中杀青30 min，于70 ℃烘干至恒重，称量干重，通过以下公式计算含水量和干物质量。
单位面积含水量=(鲜重-干重)/面积；
单位面积干质量=干重/面积。
1.6 数据处理
通过Excel 2019进行数据统计与处理；
利用SPSS 25进行独立样本t检验(P<0.05)；
采用SigmaPlot 10.0软件作图。
2.1 山茶和西洋杜鹃的抗旱性比较
图2显示，山茶和西洋杜鹃生长土壤水势在自然干旱早期(第0～6天)与对照相比均变化不显著，而从第9天开始显著降低(图2)；
在自然干旱第9和12天，山茶和西洋杜鹃生长土壤水势之间并没有显著差异(图2)。这表明停止浇水后，两种植物生长土壤水分保持一致且是呈现连续降低的，并没有由于植物蒸腾速率差异引起土壤水分显著改变。
同时，干旱胁迫后山茶和西洋杜鹃叶片和花瓣水势测定结果(图3)显示，与正常浇水(对照)相比，自然干旱后第0～9天后，山茶叶片和花瓣水势未出现显著变化(图3，A、C)，而西洋杜鹃的叶片和花瓣水势在自然干旱后第9天显著降低(图3，B、D)；
在自然干旱持续到第12天时，两种植物叶片和花瓣的水势均比对照显著降低(图3)，此时从形态表型(图4)上来看，西洋杜鹃已全部萎蔫，而山茶只有少数花朵出现萎蔫现象(白色箭头所示)。这些结果表明，两种观赏植物叶片和花瓣的水势在干旱胁迫下均表现出下降趋势，但西洋杜鹃下降得更快、幅度更大，抗旱性较差。
同期不同小写字母代表对照和干旱处理之间在0.05水平差异显著(P <0.05)图2 干旱胁迫下山茶和西洋杜鹃土壤水势比较Different normal letters within same time point represent the significant difference between the control and drought treatment at 0.05 level (P <0.05)Fig.2 Comparison of soil water potential between C. japonica and R. hybridum under drought stress
ns代表对照和干旱处理之间的差异不显著，*代表对照和干旱处理之间在0.05水平差异显著(P <0.05)图3 干旱胁迫下山茶叶片(A)、西洋杜鹃叶片(B)、山茶花瓣(C)和西洋杜鹃花瓣(D)水势ns represents no significant difference between control and drought treatment,* represents significant difference between control and drought treatment at 0.05 level (P <0.05)Fig.3 Water potential of C. japonica leaf (A),R. hybridum leaf (B),C. japonica petal (C) and R. hybridum petal (D) under drought stress
白色箭头显示干旱胁迫下花朵萎蔫图4 干旱胁迫下山茶和西洋杜鹃表型变化(比例尺=30 cm)White arrows show the withering of flowers under drought stressFig.4 Phenotypic changes of C. japonica and R. hybridum under drought stress (scale=30 cm)
2.2 山茶和西洋杜鹃花瓣和叶片光学栓塞脆弱性
在透射光下可以清晰地观察到花瓣和叶片的导管网络结构(图5)。其中，山茶花瓣、西洋杜鹃花瓣、山茶叶片和西洋杜鹃叶片在脱水过程中分别拍摄了62.8、38、51.9和8.2 h后，所有的栓塞事件已完全呈现。通过ImageJ软件分析初始栓塞发生时间为西洋杜鹃叶片1.9 h、山茶叶片27.4 h、西洋杜鹃花瓣27.6 h和山茶花瓣38.9 h；
在西洋杜鹃和山茶叶片中，较大的叶脉内显示了不同颜色的叠加，说明在叶脉内经历多次栓塞事件，根据水势分配的颜色标签，西洋杜鹃叶片、山茶叶片、西洋杜鹃花瓣和山茶花瓣在水势分别为-2.62、-4.56、-2.83和-3.96 MPa时开始出现栓塞(图5)。
图5 自然干旱下山茶花和西洋杜鹃花瓣和叶片的光学图像(左)和彩色图谱(右)Fig.5 Optical image (left) and color map (right) of petals and leaves of C. japonica and R. hybridum under natural drought stress
根据拟合的栓塞脆弱性曲线，每个物种的叶片和花瓣的曲线大致遵循S型(Sigmoidal function)函数(图6，A、B)，同一物种的相同组织中曲线具有很好的相似性，表明通过光学方法绘制的栓塞脆弱性曲线具有很好的重复性。此外，不同物种不同组织的脆弱性曲线几乎没有重叠，尤其是叶片组织。在自然干旱过程中，西洋杜鹃叶片栓塞形成迅速，脆弱性曲线更陡峭，西洋杜鹃叶片完全栓塞后，山茶叶片才开始出现栓塞(图6，B)。同时，两种观赏植物叶片的P50值(发生50%栓塞时对应的水势值)均小于花瓣，表明在干旱胁迫下花瓣组织先发生栓塞；
西洋杜鹃花瓣和叶片的P50值分别为-3.24 MPa和-4.40 MPa，显著高于山茶花瓣(-3.99 MPa)和叶片(-5.92 MPa)(图6，C)，表明在干旱条件下西洋杜鹃花瓣和叶片比山茶花瓣和叶片更容易发生栓塞。
2.3 山茶和西洋杜鹃花瓣和叶片形态结构特征
植物在遭受干旱胁迫时，组织形态结构特征对其抗旱性具有重要影响。两种观赏植物花瓣和叶片的形态结构特征(厚度、上表皮厚度、下表皮厚度、栅栏组织、海绵组织、叶脉密度、气孔密度)测定结果(表1)显示，山茶和西洋杜鹃间的花瓣厚度、上表皮厚度、下表皮厚度没有显著差异，而山茶花瓣的脉密度和气孔密度均显著大于西洋杜鹃花瓣；
在叶片的形态结构中，山茶叶片厚度、上表皮厚度、下表皮厚度、海绵组织厚度、叶脉密度均显著大于西洋杜鹃，气孔密度显著低于西洋杜鹃。
表1 山茶和西洋杜鹃花瓣和叶片的形态特征Table 1 Morphological characteristics of petals and leaves of C. japonica and R. hybridum
A和B中同一植物的3条曲线代表3个重复，不同小写字母表示不同植物相同组织之间P50值在0.05水平差异显著(P <0.05)图6 山茶和西洋杜鹃花瓣(A)和叶片(B)的光学栓塞脆弱性曲线及P50值(C)The three curves of the same plant in Fig.A and B represent three repeats,and different normal letters indicate significant differences in P50 values between same tissues in different plants at 0.05 level (P <0.05)Fig.6 Optical embolism vulnerability curves of C. japonica and R. hybridum petals (A) and leaves (B) and P50 (C)
2.4 山茶和西洋杜鹃花瓣和叶片持水性
植物组织含水量和干物质量是反映植物水分盈缺和光合作用状况的重要指标[25-26]。山茶和西洋杜鹃花瓣及叶片的单位面积含水量和单位面积干物质量测定结果(图7)显示，山茶花瓣和叶片的单位面积含水量和单位面积干物质量均显著高于西洋杜鹃，表明抗旱性强的山茶叶片和花瓣含水量和干物质量较大。
不同小写字母代表山茶和西洋杜鹃之间在0.05水平差异显著(P <0.05)图7 山茶和西洋杜鹃花瓣和叶片含水量(A)和单位面积干重(B)The different normal letters represents significant difference between C. japonica and R. hybridum at 0.05 level (P <0.05)Fig.7 Water content (A) and dry matter mass (B) of petals and leaves of C. japonica and R. hybridum
植物通常从土壤中吸收水分，土壤水势是用于衡量土壤干旱程度及植物可利用水分的重要指标[27]。在土壤-植物-大气连续体系统中，当土壤水势降低于一定阈值时，土壤含水率快速下降[28-29]。在本研究中，西洋杜鹃和山茶两种植物生长的土壤水势在干旱早期(第0～6 d)虽有降低但变化不显著，推测干旱9 d是土壤水分变化的阈值。尽管土壤水势在干旱第9天显著降低，但此时山茶的花瓣和叶片水势未表现出显著的变化，且山茶的花瓣和叶片表型未受到严重影响，表明它的抗旱性强于西洋杜鹃。
同时，水力分割理论认为，在干旱期间植物往往会先牺牲重要性较小和投资成本较小的器官来拯救对植物长期生存和繁殖至关重要的器官[30]。从本研究栓塞脆弱性曲线和P50值可以看出，两种花卉植物的花瓣组织比叶片更脆弱，表明山茶和西洋杜鹃植物在干旱条件下优先牺牲花瓣组织从而保存叶片组织，这与水力分割理论一致，因为与叶片相比，花瓣的投资成本更小。从不同组织栓塞发生时间来看，本研究中两种花卉植物的花瓣发生栓塞的时间都比叶片延迟，但花瓣的P50高于叶片，因此，栓塞发生快慢不能作为评价植物组织抗旱性指标。
另外，本实验结果表明，抗旱性强的山茶叶片厚度、上下表皮、栅栏组织和海绵组织都大于西洋杜鹃。厚的叶片储水能力较强，而较厚的表皮能有效降低水分的蒸腾作用，同时在一定程度上避免光照对叶肉组织的灼伤[31-32]。发达的栅栏组织可增加水分从维管束到表皮间的运输效率，增加叶肉细胞的表面积，从而保证植物光合作用对水分的需求[33]。大量的海绵组织利于植物与外界进行气体交换，植物充分利用光照维持较高的光合速率[34]。这些有利于植物保水和节水的形态结构特征，缓解了植物在干旱环境下水分亏缺，延缓栓塞的形成，从而增强植物的抗旱能力。叶脉是叶片组织水分运输的主要通道[35]，当叶脉发生栓塞时，部分未发生栓塞的叶脉继续运输水分，这与本研究发现的山茶花瓣和叶片中脉密度高于西洋杜鹃的结果相吻合。气孔是植物水分散失的主要通道，与植物蒸腾作用、光合作用以及环境变化、气候变化等密切相关[36-37]。前期研究表明，气孔密度越大植物越抗旱，较高的气孔密度能提高叶片光合效率，从而在干旱胁迫下能保持相对稳定的光合速率，缓解干旱胁迫所带来的光合损伤[38-41]。但本研究与前人研究结果相反，较抗旱的山茶叶片的气孔密度低于西洋杜鹃。除气孔密度外，山茶的叶片形态，如叶片厚度、上下表皮等都显著大于西洋杜鹃，我们猜测山茶可能更多依赖叶片形态结构来提高植物抗旱性，而通过增加气孔密度来提高植物的抗旱性的贡献则不大。尽管在山茶花瓣中观察到稀疏的气孔，但山茶花瓣组织上的气孔可能不是控制水分蒸腾和CO2进出的结构[42]；
另外，有研究结论认为花瓣上的气孔起到控制花瓣开闭的功能[43]。到目前为止，花瓣组织上的气孔功能研究较少，它对花瓣栓塞脆弱性的贡献仍需进一步探讨。
此外，水力障碍是干旱胁迫期间植物死亡的主要决定因素[44]。在干旱胁迫下，木质部导管负责在负张力下将水分从土壤中提出来，补充植物组织因蒸腾作用散失的水分[45]。西洋杜鹃叶片和花瓣组织含水量越少，在干旱胁迫期间散失水分较快，木质部导管在强张力下运输水分，增加了栓塞形成的风险。
栓塞脆弱性作为植物抗旱性的重要指标，山茶和西洋杜鹃花瓣和叶片在干旱过程中都发生栓塞。通过分析两种植物花瓣和叶片栓塞脆弱性发现，山茶花瓣和叶片栓塞脆弱性小于西洋杜鹃。山茶和西洋杜鹃间的花瓣厚度、上下表皮厚度没有显著差异，而山茶花瓣的脉密度和气孔密度均显著大于西洋杜鹃花瓣；
在叶片的形态结构中，山茶叶片厚度、上下表皮厚度、海绵组织厚度、叶脉密度均显著大于西洋杜鹃，而气孔密度显著低于西洋杜鹃。山茶和西洋杜鹃的栓塞脆弱性与其组织形态结构有关，叶片厚度、上下表皮厚度、海绵组织厚度越厚,栓塞脆弱性越小。本实验结果表明，在未来气候逐渐变暖的趋势下，可以优先选择山茶作为城市绿化的植物。