张 犇， 郭 悦， 刘丽文， 郝冬冬， 王小霞， 杨 埔， 张丽珍
(1)山西大学生命科学学院， 太原 030006；
2)山西农业大学省部共建有机旱作农业国家重点实验室(筹)， 太原 030006)
谷子(SeteriaitalicL.)起源于中国，是亚洲干旱和半干旱地区的一种重要粮食和饲料作物。谷子是二倍体禾本科C4作物，优良的耐旱性、较小的基因组(约515 Mb)、自花授粉和较短的生命周期，使谷子成为研究抗逆性的新型C4模式作物[1]。谷子耐旱性和水分利用效率明显高于大多数禾本科作物，例如玉米、小麦和高粱[2, 3]，针对谷子耐旱性开展研究，揭示其分子机制，将为作物生物育种提高胁迫抗性提供潜在位点及理论支持。
土壤控水干旱胁迫与聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)处理带来的渗透压胁迫模拟干旱胁迫，是植物学研究中施加干旱胁迫的常见手段[4-7]。然而，PEG处理在实施过程中通常以短期处理形式存在，对植物带来的胁迫影响迅速而强烈，与相对长期的土壤控水干旱胁迫存在区别。Kautz等[8]研究发现，PEG处理与缺水干旱对苹果苗含水率及叶绿素含量等指标影响相似，但对于叶片厚度及脯氨酸含量的影响存在区别。本实验室前期工作中，比较了陇谷16、晋谷21和冀谷39对土壤缺水胁迫的耐受区别，并开展了胁迫下，3个品种转录组差异分析[9]。不同品种谷子间对土壤控水干旱胁迫及PEG胁迫耐受区别是否一致，尚未见报道。谷子中短期PEG处理是否可以模拟长期缺水干旱胁迫，是谷子抗旱优势抗性机制研究实验开展的基础，尚有待进一步研究。
植物对干旱胁迫的响应是一个复杂的过程。干旱胁迫下，植物调整脱落酸(abscisic acid，ABA)及ROS(reactive oxygen species)信号通路，调控胁迫响应基因表达，通过积累渗透物质、调整气孔运动与光合作用水平、调整水分吸收及生长发育等生理活动对胁迫作出响应[10, 11]。在分子水平，参与植物干旱胁迫响应的基因较多。真核生物细胞中存在一类蛋白质可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体(soluble-N-ethylmaleimide-sensitive-factor accessory-protein receptor，SNARE)，它的主要功能为在膜泡运输过程中介导转运泡膜与靶膜融合，并参与调控植物细胞板的形成、向重力性和离子运输等活动[12]。根据SNARE基序的氨基酸序列特征，把SNARE复合体核心结构中含有谷氨酰胺的蛋白质称为Q-SNARE，含有精氨酸的称为R-SNARE[13]。在不同植物中大量存在的SNARE基因，提示这一家族基因在植物适应陆生生活，应对胁迫响应中的重要作用[14]。在拟南芥中，Q-SNARE蛋白质SYP121参与ABA处理下的离子通道调控，影响植物气孔运动及干旱胁迫响应[15, 16]。进一步机制研究揭示，SYP121从影响亚细胞定位及通过直接相互作用提高活性2个角度调控钾离子通道，并进而影响植物胁迫响应[17-20]。SYP41-SYP61蛋白质复合体参与植物对盐及渗透压胁迫耐受，后者直接参与调控细胞质膜水孔通道转运及活性[21, 22]。R-SNARE又称囊泡相关膜蛋白(vesicle associated membrane proteins，VAMP)，可进一步分为Sec22、YKT6和VAMP7三组[23]。其中，对于VAMP7蛋白的研究较深入。在拟南芥中，抑制Vamp71基因表达影响气孔关闭，提高植物对盐胁迫耐受[24, 25]。Zhang等[26]研究发现，VAMP721与钾离子通道具有直接相互作用，并抑制通道活性，提示VAMP7蛋白参与钾平衡并极有可能进一步影响植物气孔运动及干旱响应。结合上述对Q-SNARE的研究，SYP121-SYP41/SYP61-VAMP711/721所形成的SNARE复合体，对离子通道及水孔通道的调控在植物对干旱、盐等非生物胁迫响应中发挥关键作用。在作物中，VAMP7蛋白在非生物胁迫中的作用也有报道。在大豆中，Sun等[27]研究发现，GsVAMP72高度参与调节植物对盐和ABA胁迫的响应。在小麦中，干旱和盐胁迫都能诱导TaVamp714上调表达[28]。在花生中，AdVamp18、AdVamp21、AdVamp14和AdVamp5被预测在花及种子形成过程中可能发挥着重要作用[29]。在本实验组前期工作中，基于水稻及拟南芥基因信息，筛选鉴定了谷子中SNARE家族基因，并初步分析了它们对于非生物胁迫的响应[30]。在苗期缺水干旱下，谷子中SiVamp711、SiVamp721、SiVamp722和SiVamp726表达上调，SiVamp713与SiVamp727表达下调[30]。PEG处理下，SiVamp7基因是否具有类似响应尚不清楚。本研究将进一步测定PEG处理下，SiVamp7基因水平变化，通过与缺水干旱结果比较，从SiVamp7基因响应角度分析2种干旱处理的区别。
本研究选取山西、甘肃、河北、山东等省的代表性谷子品种陇谷16、晋谷21、冀谷39、大同40和济谷22，采用土壤控水干旱胁迫和PEG模拟干旱胁迫对谷子幼苗进行处理，研究谷子苗期在2种干旱胁迫下的 生理响应与抗旱表现的异同。晋谷21是山西省谷子的主栽品种，在山西省谷子生产上占主导地位，其干旱胁迫抗性在测试品种中居中[31]。本研究进一步测定晋谷21中SiVamp7家族基因对不同干旱胁迫的响应，及其与谷子钾离子通道的选择性互作，为谷子干旱胁迫机制研究奠定基础。
1.1 谷子培养及胁迫处理手段
本研究的5种供试种子品种分别为陇谷16、晋谷21、冀谷39、大同40和济谷22，所有材料均为山西大学生命科学学院张丽珍教授课题组提供并且仅用于研究使用。
将种子播撒于营养土与蛭石1∶1的固体混合物中，置于23～26 ℃，50 000 Lux光照，16 /8 h光周期，30%～50%相对湿度的温室条件下生长4 d，将长势一致的双叶期幼苗移至新的育苗盆，每盆3株。幼苗继续生长14 d，一组停止浇水14 d进行土壤控水干旱处理。另一组转至 1/2 MS 液体培养基培养3 d后，加入10% PEG6000以模拟干旱，并分别在2组中设立相应的对照组。分别取14 d后土壤控水干旱和10%PEG6000处理0 h、12 h、24 h的实验组和对照组样品，使用液氮速冻并存于- 80 ℃用于后续研究。
1.2 谷子生理指标检测
谷子叶片离体失水率测定参照文献[30, 32, 33]报道的方法。选取14 d龄谷子幼嫩叶片，平铺在铝箔纸上，在24～26oC室温，30%相对空气湿度下干燥，在标注时间点测定叶片重量。失水率按照与0 h比叶片残留重量百分比计算。
所有谷子样品中叶绿素，丙二醛(malondialdehyde，MDA)，谷胱甘肽(glutathione，GSH)，过氧化氢(H2O2)含量以及过氧化氢酶(catalase，CAT)和过氧化物酶(peroxidase，POD)活性均使用苏州科铭生物科技有限公司的生化检测试剂盒，并根据其说明书进行测定(CPL-1-G，MDA-1-Y，GSH-1-W，H2O2-1-Y，CAT-1-Y，POD-1-Y)。可溶性蛋白质含量使用上海生工生物工程股份有限公司生产的试剂盒(No.C503041)，根据使用说明进行检测。
1.3 谷子实时荧光定量PCR检测
取胁迫下的晋谷21样品，通过TransZolTMUP Plus RNA Kit试剂盒提取样品总RNA，使用Easy-Script®One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix 试剂盒进行反转录获得cDNA，并以此为模板使用TransStart®Tip Green qPCR SuperMix试剂盒进行RT-qPCR检测SiVamp7的转录水平。以上试剂盒均购于北京全式金生物技术有限公司。以SiAct2(Seita.8G043100)及RNA POL II(Seita.2G142700)为内参基因[34]。本研究所有引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成，并通过溶解曲线有无单峰来验证其特异性(Table S1)。RT-qPCR的结果使用2-ΔΔCT方法进行分析。为减少生物学和技术差异的影响，RT-qPCR中每个样本均使用3次生物学和3次技术重复。
1.4 酵母基于杂交的分裂泛素化系统检测蛋白质相互作用
酵母基于杂交的分裂泛素化系统(mating based Split-ubiquitin System, mbSUS)检测蛋白相互作用参照Horaruang与Zhang论文[35]进行。SiKAT3(Seita.1G020100)与泛素化标记C-端连接作为诱饵蛋白(SiKAT3-Cub)，SiVAMP7与泛素化标记N-端连接作为猎物蛋白(NubG-SiVAMP7)。NubG与NubI作为猎物蛋白质分别是本实验阴性与阳性对照。诱饵蛋白与猎物蛋白分别转入THY.AP4与THY.AP5酵母，在选择性培养基上(CSM-LM用于THY.AP4，CSM-MTU用于THY.AP5)挑取菌落，经培养杂交后在YPD培养基中生长，28 ℃培养过夜。接下来将YPD培养基上的菌落用牙签挑取至CSM-LMTU培养基，28 ℃培养2～3 d。二倍体菌落挑取并在CSM-LMTU液体培养基中28 ℃，180 rpm培养过夜。菌液经离心及无菌水重悬，调整浓度至OD600为1.0及0.1，分别点于CSM-LMTU培养基与CSM-AHLMTU培养基。前者经28 ℃培养24 h后取出拍照，酵母生长情况表明，诱饵蛋白与猎物蛋白均成功转入酵母中表达。后者中添加不同浓度甲硫氨酸，抑制pmet25启动子控制下诱饵蛋白表达，以便更明显看到生长区别，经28 ℃培养48～72 h后取出拍照。为验证蛋白质表达，二倍体酵母CSM-LMTU液体培养基培养24 h后收获，诱饵蛋白利用商品化VP16抗体免疫印迹试验检测，猎物蛋白利用HA抗体检测。
1.5 数据统计分析
每个实验至少有3个生物学重复，并进行随机采样，以确保实验结果的准确性。采用SPSS 22.0进行数据分析，各实验结果均以平均数±标准误表示。利用SigmaPlot作图。P<0.05说明差异有统计学意义。
2.1 5种不同品种谷子在土壤控水干旱胁迫和聚乙二醇胁迫下的抗旱性表现一致
陇谷16、晋谷21、大同40、冀谷39及济谷22为我国不同省份选育5种品种。为避免不同品种谷子生长周期差异对本研究带来的干扰，本研究首先在土壤培养条件下培育谷子,检测在实验周期内不同品种是否具有生长差异。结果正如Fig.S1所示，在实验条件下，5个品种谷子在发芽后30 d内生长趋势基本一致。基于这一结果，5个品种谷子播种在土壤中或移栽在1/2 MS液体培养基中，接受14 d土壤控水干旱或PEG6000模拟干旱处理24 h。结果正如Fig.1A所示，正常浇水的对照组植株直立，不萎蔫，叶片翠绿；
而实验组谷子经过14 d干旱胁迫，各品种谷子叶片有不同程度的卷曲、干枯现象。干枯程度最高为陇谷16，受干旱胁迫影响最弱为大同40与济谷22。选取这5种谷子叶片，进行离体失水率测定。结果如Fig.2所示，叶片保水能力由强到弱分别为济谷22、大同40、冀谷39、晋谷21与陇谷16。其中，冀谷39、晋谷21与陇谷16，实验结果与前期研究一致[30]。由以上结果可以得出，谷子抗旱能力由弱到强分别为陇谷16、晋谷21、冀谷39、大同40、济谷22。
Fig.1 Effects of water-limiting drought and PEG6000-simulate drought stress on the growth of foxtail millet Two-week-old seedlings of five cultivars of foxtail millet were treated with stop-watering drought stress for 14 days or 10% PEG6000 simulated drought stress for 24 hours, respectively. (A) The phenotype of stop-watering drought stress; (B) Phenotypes of PEG-simulated drought stress
Fig.2 Determination of the water loss rate in detached leaves of foxtail millet Leaves of 14-day-old foxtail millet of five cultivars were dried at room temperature of 24-26 ℃ and 30% relative air humidity, and the leaf weight was measured at the marked time point (n=3). The water loss rate is calculated as a percentage of the residual weight of the blade compared to 0 hour. The results showed that the strong to weak water retention capacity of leaves was Jigu 22, Datong 40, Jigu 39, Jingu 21, and Longgu 16, respectively
选择长势基本一致的幼苗进行10% PEG-6000处理，以0 h为对照，胁迫处理12 h、24 h后观察幼苗生长状态。结果明显看出，12 h时，陇谷16、晋谷21叶片明显卷曲，其余品种叶片无明显变化。胁迫24 h时，冀谷39出现轻微卷曲，陇谷16卷曲程度最为严重，大同40、济谷22叶片变化不明显(Fig.1B)。说明抗旱能力由弱到强分别为陇谷16、晋谷21、冀谷39、大同40、济谷22，与土壤控水干旱胁迫下抗旱表现一致。
2.2 控水及聚乙二醇模拟干旱胁迫下部分谷子叶绿素含量的变化不同
干旱胁迫下植物叶绿素合成受到抑制，分解加快，光合作用受到影响[36]。在干旱胁迫条件下，能够保持较高叶绿素含量的植物被认为具有更强的抗性。Fig.3显示了控水及PEG模拟干旱胁迫下，5种谷子品种的叶绿素含量变化。经过14 d的长期土壤控水干旱胁迫，陇谷16、晋谷21、冀谷39的叶绿素含量分别降低了64.3%、51.7%、39.9%；
而大同40、济谷22的叶绿素含量分别升高了63.6%、76.4%，说明大同40、济谷22在胁迫条件下可以保持较高的光合作用速率，再一次验证了前文中参试谷子的抗旱性。
Fig.3 Effects of water-limiting drought and PEG stress on chlorophyll contents of foxtail millet The two-week-old seedlings of five cultivars of foxtail millet were treated with water-controlling drought treatment in the soil after 14 days and simulated drought treatment with 10% PEG6000 for 24 hours. The chlorophyll contents in the leaves under the water-controlling drought treatment 0 day and 14 days (left panel) and PEG stress at 0 hour, 12 hours, and 24 hours (right panel) were measured, respectively. Each data value is expressed as mean ± standard error (n=9). The asterisk indicated that the chlorophyll content after stress significantly differed from that of the control at 0 h. *P<0.05
PEG短期胁迫12 h，除陇谷16的叶绿素维持不变，其他品种均显著上升；
胁迫24 h，各品种叶绿素含量较12 h又有所上升，显著高于对照(0 h)。与0 h相比，胁迫24 h后，陇谷16、晋谷21、冀谷39、大同40、济谷22的叶绿素含量分别上升36.0%、153.3%、82.8%、167.0%、74.4%。与敏感品种相比较，抗旱品种的叶绿素含量上升速度更为迅速。
2.3 控水及聚乙二醇模拟干旱胁迫下晋谷21和济谷22的可溶性蛋白质含量变化趋势不同
植物对干旱胁迫的响应是一个复杂的过程，涉及众多相关基因和信号通路的调控。作为植物内的重要代谢副产物与信号物质，活性氧与植物抗旱性强弱密切相关[10, 37]。
丙二醛作为膜脂过氧化的终产物，其含量高低反映了胁迫下膜脂的氧化损伤程度。正如Fig.4A所示，在不同干旱胁迫下，除济谷22外，其余谷子叶片的MDA含量显著提高(P<0.05)。土壤控水长期干旱下，陇谷16膜脂受损程度相对最高，其MDA含量升高201.5%，而大同40(49.2%)、济谷22(25.4%)的膜脂受损程度相对较低。在PEG短期胁迫下，5个品种谷子幼苗的MDA含量均随着胁迫时间延长而持续升高。与对照0 h相比，胁迫12 h时，陇谷16、晋谷21、冀谷39、大同40、济谷22叶片中MDA含量分别上升了16.5%、44.2%、23.2%、32.4%、23.0%，此时陇谷16的膜脂过氧化程度相对较低。但24 h胁迫处理后，陇谷16叶片MDA含量急剧上升，达到83.2%，表明PEG处理24 h后陇谷16应对膜脂氧化损伤能力开始下降，这可能是造成陇谷16干旱胁迫下生长状态最差的原因之一。
Fig.4 Effects of water control drought and PEG stress on the MDA level (A), GSH level (B), and soluble protein content (C) in foxtail millet The two-week-old seedlings of five cultivars of foxtail millet were treated with water-controlling drought treatment in the soil after 14 days and simulated drought treatment with 10% PEG6000 for 24 hours. The contents of the MDA, GSH, and soluble protein in the leaves under the water-controlling drought 0 day, 14 days, and PEG stresses at 0 hour, 12 hours, and 24 hours, respectively. Each data value is expressed as mean ± standard error (n=9). The asterisk indicated a significant difference compared with the control after stress. *P<0.05
谷胱甘肽参与抗坏血酸-谷胱甘肽循环，可以减轻ROS对细胞的损害。前人的研究已经证明，SO2能够通过调节谷胱甘肽稳态来提高谷子幼苗的抗旱性[38]。在干旱胁迫下，各品种GSH含量均显著上升(P<0.05)。其中，大同40的上升幅度最大，胁迫后GSH含量上升了3.8倍。在PEG胁迫下，各品种谷子叶片GSH含量随胁迫时间延长而上升(P<0.05)。胁迫24 h时，与0 h相比，陇谷16、冀谷39、大同40上升幅度较大，分别上升2.5、2.8、2.7倍。
植物可以通过细胞内渗透调节物质的增加，降低渗透势以维持水分平衡。可溶性蛋白质水平是反应植物胁迫下渗透物质积累的指标之一[39, 40]。症如Fig.4C所示，土壤控水干旱胁迫下，陇谷16的可溶性蛋白质含量无显著变化，晋谷21、冀谷39的可溶性蛋白质含量显著升高，分别升高108.0%、55.3%；
大同40、济谷22的可溶性蛋白质含量显著降低，分别降低了48.4%、20.7%。PEG短期胁迫下，济谷22的可溶性蛋白质含量持续显著上升，与0 h相比，胁迫24 h后上升了15.7%；
陇谷16、晋谷21、大同40则显著降低，与0 h相比，胁迫24 h后分别降低了36.1%、20.3%、45.3%。冀谷39的可溶性蛋白质含量呈先上升后下降趋势，且胁迫24 h(3.1 mg/g)后的平均含量显著高于0 h(2.7 mg/g)。
以上结果表明，2种胁迫处理下，5种谷子干旱胁迫相关生理指标测定结果趋势相似。但在济谷22的MDA水平及陇谷16可溶性蛋白质水平上，2种处理导致变化不同，表明2种处理不能简单替换。
2.4 聚乙二醇模拟干旱胁迫下谷子抗氧化酶活性升高
活性氧的产生与积累，是植物在非生物胁迫下最早最快速的反应之一[41, 42]。一方面，活性氧作为第二信使参与一系列生理反应；
另一方面，过度积累的活性氧也带来对植物生长发育的不利影响。上述结果显示，干旱胁迫下，谷子受到氧化损伤。为进一步探索干旱胁迫下不同谷子活性氧积累及清除情况，本文选择检测了PEG短期胁迫下样品的H2O2积累及过氧化氢酶、过氧化物酶活性变化情况。H2O2的检测结果显示(Fig.5A)，陇谷16、晋谷21、大同40叶片中H2O2含量随胁迫时间延长呈先升高后降低再升高的趋势。植物抗氧化酶活性的高低可以反映抗旱性的强弱。PEG处理下，参试品种叶片过氧化氢酶及过氧化物酶活性均随胁迫时间的延长呈先升高后降低的变化趋势。其中，陇谷16、晋谷21、冀谷39、济谷22和大同40参试谷子过氧化氢酶活性均在胁迫4 h时达到最高，分别为69.8、73.6、85.4、89.5和105 U/mg蛋白质。对于过氧化物酶(POD)，陇谷16(158.8 U/mg蛋白质)、晋谷21(134.0 U/mg蛋白质)的POD活性在胁迫2 h时达到最高，冀谷39(181.2 U/mg蛋白质)、济谷22(177.6 U/mg蛋白质)的POD活性在胁迫4 h时达到最高，大同40(193.3 U/mg蛋白质)的POD活性在胁迫12 h时达到最高。在整个胁迫过程中，冀谷39、大同40、济谷22可以保持较高水平的抗氧化酶活性，不断清除活性氧降低胁迫造成的伤害，因此，具有更强的抗旱性。
Fig.5 H2O2 accumulation and active oxygen scavenging enzyme activity changes in foxtail millet under simulated drought stress with PEG 6000 Two-week-old seedlings of five cultivars of millet were treated with 10% PEG6000 simulated drought, and the changes of H2O2 contents (A), CAT (B), and POD (C) in leaves were observed within 24 hours at intervals of 4 hours. Each data value is expressed as mean ± standard error (n=9)
2.5 控水干旱与聚乙二醇模拟干旱胁迫对谷子SiVamp7家族基因转录水平的调控不同
上述研究表明，长期控水干旱及短期PEG胁迫下，不同谷子耐受水平相似。但2种胁迫下，不同谷子活性氧迸发、清除及受到活性氧胁迫的生理指标变化不同。VAMP7是SNARE蛋白质家族成员，主要表达在转运泡膜上，参与介导SNARE复合体的形成并最终完成膜融合过程。在拟南芥中，Vamp71基因参与ABA及干旱胁迫下植物活性氧代谢及胁迫耐受过程[25, 43]。为进一步从分子生物学水平比较2种胁迫处理的区别，本文选择在晋谷21中测定并比较2种胁迫方式下SiVamp7基因转录水平变化。
VAMP7蛋白在植物中普遍存在，其中小麦、水稻、拟南芥中该家族分别有23、8、12个成员[44, 45]。在前期工作中，我们发现谷子中存在10个SiVAMP7成员[30]。基于水稻、谷子、小麦以及模式植物拟南芥的VAMP7家族蛋白质序列进行系统进化树的构建与比对，谷子VAMP7蛋白质家族可以被分成VAMP71以及VAMP72共2个亚家族，谷子SiVAMP7蛋白质家族与水稻、小麦的亲缘关系较近，而与拟南芥的亲缘关系较远(Fig.6)。
Fig.6 Protein evolution comparison of the VAMP7 family in different plants The yellow circle represents millet, the red circle represents Arabidopsis, the green triangle represents rice, and the blue diamond represents wheat. The evolution tree is divided into two branches, the red label represents the VAMP72 family, and the blue label represents the VAMP71 family
我们前期工作中，测定了14 d控水干旱胁迫下谷子晋谷21SiVamp7家族基因转录水平。结果表明，控水干旱胁迫上调SiVamp711、SiVamp721、SiVamp722、SiVamp725与SiVamp726水平，下调SiVamp713与SiVamp727水平[30]。本研究PEG6000模拟干旱处理时间为0 h，12 h与24 h，考虑到部分基因可能受时间节律影响，本文在对照组中同样时间点取样对SiVamp7转录水平进行了实时荧光定量PCR测定。结果正如Fig.7所示，除SiVamp725受时间节律影响上调以外，其它SiVamp7基因转录水平在24 h内不变。
Fig.7 Transcription levels of the SiVamp7 genes of Jingu 21 under simulated drought stress with PEG 6000 Two-week-old Jingu 21 seedlings were treated with 10% PEG6000+1/2MS (experimental group) and 1/2MS (control group), respectively, and RT-qPCR identified the transcription levels of the SiVamp7 genes in leaves at 0 hour, 12 hours and 24 hours. Each data value is expressed as mean ± standard error (n=3). The asterisk indicates that the transcription level of this gene under different treatments is significantly different from that at 0 h. *P<0.05
正如Fig.7所示，在PEG6000模拟干旱胁迫(0 h，12 h和24 h)下，SiVamp7基因转录水平发生变化。在2种胁迫下，SiVamp721转录水平上调，而SiVamp723与SiVamp724转录水平均保持不变。对于其它SiVamp7基因，2种胁迫带来的转录水平变化不同。短期PEG胁迫诱导SiVamp712与SiVamp713表达，而在长期控水干旱下，SiVamp713水平下降。SiVamp711仅在控水干旱下上调。SiVamp722转录水平在长期控水干旱胁迫下上调，在PEG处理下下调。SiVamp726在控水干旱胁迫下上调，但在PEG处理下，于12 h后诱导表达，在24 h表达水平恢复。SiVamp727仅在长期控水胁迫时下调。值得注意的是，PEG6000处理下调SiVamp725水平，提示对照组中所显示的SiVamp725受时间节律上调在PEG模拟干旱胁迫下消失。以上结果表明，控水干旱与PEG胁迫对部分SiVamp7家族基因表达影响不同。
2.6 SiVAMP7蛋白与钾离子通道SiKAT3间存在选择性相互作用
在拟南芥中的研究表明，SNARE蛋白特别是VAMP7蛋白通过与钾离子通道的相互作用影响后者活性，并进一步参与调控植物非生物胁迫响应[26, 46]。我们前期工作中，筛选鉴定了谷子细胞质膜电压门控钾离子通道[47]，其中SiKAT3在谷子中不同组织不同时期，特别是叶片中表达，提示这一蛋白质可能和拟南芥KAT1(Potassium Channel inArabidopsisThaliana1，AT5G46240)类似，参与保卫细胞钾吸收，并影响气孔运动。为了进一步探索不同干旱胁迫下SiVamp7基因转录水平变化的意义，本文利用mbSUS法研究了SiKAT3与SiVAMP7蛋白质的互作情况。在mbSUS法中，诱饵与猎物蛋白分别连接泛素化标记片段，蛋白质相互作用恢复泛素化标记功能，切割猎物蛋白上连接的报告基团。该基团进入细胞核启动报告基因表达，使得酵母可以在选择性培养基上生长。该方法适用于膜蛋白互作研究，用于揭示拟南芥SNARE蛋白与钾离子通道蛋白间的互作规律[20, 26]。结果如Fig.8所示，酵母表达SiKAT3与SiVAMP711、SiVAMP723、SiVAMP724、SiVAMP725或SiVAMP727蛋白质在选择性培养基上生长，提示存在蛋白质相互作用，右侧免疫印迹结果表明，诱饵与猎物蛋白质在酵母中表达。结合Fig.7所示结果，胁迫下部分互作SiVamp7基因(例如SiVamp711、SiVamp724、SiVamp725、SiVamp727)表达水平变化，很可能通过影响钾通道活性，进而参与调控谷子干旱胁迫耐受。
Fig.8 Selective interaction of SiKAT3 with SiVAMP7 proteins The mbSUS method was used to detect the interaction of SiKAT3 with SiVAMP7 proteins. SiKAT3 was connected with the ubiquitination-labelled C-terminal as the bait protein (SiKAT3-Cub), and SiVAMP7 was connected with the ubiquitination-labelled N-terminal as the prey protein (NubG-SiVAMP7). NubG and NubI were used as negative and positive controls for prey protein, respectively. Yeast results indicated that SiKAT3 grew on selective media with protein interactions with SiVAMP711, SiVAMP723, SiVAMP724, SiVAMP725, and SiVAMP727 proteins. Western blotting results are shown on the right. Bait proteins were detected using commercial VP16 antibodies, and prey proteins were detected using HA antibodies. The results showed that both bait and prey proteins were expressed in yeasts
干旱胁迫限制植物生长，对农业生产具有严重影响。谷子作为一种耐旱耐贫瘠的C4作物，揭示其干旱分子机制，将为作物抗旱为目的的分子育种提供理论基础。在植物干旱胁迫相关研究中，利用PEG6000处理模拟胁迫是一种常见手段[4-7]。PEG6000带来的根系渗透压胁迫是植物在干旱条件下承受的胁迫之一，但实际生长环境中土壤缺水对植物生长带来的影响要复杂得多[8]。因此，是否可以利用PEG渗透压胁迫替代土壤缺水干旱胁迫，准确反映出植物抗旱性强弱并开展相关研究，将是加速植物干旱胁迫响应分子机制研究的关键。在揭示谷子抗旱分子机制过程中也极有意义。因此，本文选择5种不同谷子品种，比较它们在控水干旱及PEG胁迫下响应，从活性氧相关生理水平指标及SiVamp7基因转录水平指标出发，评估了谷子对2种胁迫方式响应的异同。并进一步从与钾离子通道互作出发，探索SiVAMP7与钾离子通道互作，探索导致2种胁迫响应不同的潜在机制。
研究结果表明，5种谷子对2种胁迫的耐受水平一致，由弱到强分别为陇谷16、晋谷21、冀谷39、大同40、济谷22，表明在初步评估品种抗旱性过程中可以选择PEG模拟干旱胁迫。陇谷16在胁迫下缓解氧化损伤能力较差，叶绿素水平下降，生长受到抑制。而抗性较强的品种在维持高抗氧化能力的同时，积累可溶性物质，有效抵消了胁迫对植物水分平衡的影响。此外，生理指标检测也显示，短期PEG胁迫与长期控水干旱的结果有显著差异。结果正如Fig.3所示，与光合密切相关的叶绿素含量指标测定表明，短期胁迫下，5个品种叶绿素含量都有所上升，而在长期控水干旱下，仅有抗性较好的济谷22、大同40叶绿素含量上升(P<0.05)。这一方面表明，由于缺水或主动应对水分缺乏环境，陇谷16、晋谷21、冀谷39在胁迫下的叶绿素水平下降(P<0.05)，表明不同品种谷子应对胁迫策略不同；
另一方面，上调的叶绿素含量也进一步证明，济谷22、大同40适应干旱环境，抗性较好。此外，正如Fig.4所示，短期胁迫导致5个品种MDA水平上升，说明细胞受到氧化损伤；
而在长期控水干旱下，抗旱性较好的济谷22中，MDA水平与对照组无显著差异，表明在长期干旱下，济谷22保持正常氧化平衡，适应了缺水环境。以上结果与杨娟等在PEG处理对不同品种玉米影响的研究结论相似[6]。不同胁迫下，差异生理结果表明，谷子可能通过不同的途径响应2种处理，因此在生理水平机制研究中，2种处理不能简单替代。
在分子生物学水平，本文比较了2种胁迫下晋谷21中SiVamp7基因转录水平变化。SiVAMP7是谷子SNARE蛋白家族的成员。SNARE蛋白在植物中保守，主要参与膜泡转运过程，并在植物激素信号转导、生物及非生物胁迫响应、向重力性形成及细胞板形成等生理和活动中发挥作用[23]。近年来研究表明，一些SNARE蛋白质通过与离子通道直接互作，参与调控植物水分及离子平衡[20, 22]。对拟南芥Vamp7基因的研究表明，抑制Vamp71基因表达影响含H2O2膜转运泡的运输，导致ABA处理造成的气孔运动受到抑制，植物对干旱胁迫敏感[24, 25]，表明这一基因家族在干旱胁迫下依赖ROS的植物响应中发挥关键作用。我们前期工作中，已经初步确定谷子中存在10个SiVamp7基因，同时发现经过14 d控水干旱胁迫，部分谷子SiVamp7基因转录水平发生变化[30]。本研究探索24 h内PEG6000模拟干旱处理对SiVamp7基因转录水平的影响。由于植物中约30%基因转录水平受到昼夜时间节律影响[48]，SiVamp7基因是否在24 h内受昼夜节律调控将影响PEG6000模拟干旱处理实验结果。在对照无处理谷子中，0 h，12 h和24 hSiVamp7基因转录水平得到测定。结果如Fig.7所示，多数SiVamp7基因转录水平未受昼夜节律影响，只有SiVamp725水平在24 h内上调。
正如Fig.7所示，对SiVamp7基因转录水平检测表明，该基因家族对2种不同胁迫的响应不同，说明在分子生物学研究水平 不能简单将PEG渗透压胁迫直接视为控水干旱胁迫。谷子SiVamp712、SiVamp713基因在短期PEG渗透压胁迫下转录水平上升。拟南芥中该家族同源基因主要分布在向液泡转运的膜泡上[44]，且参与调整干旱胁迫下ROS分布[24, 25]。谷子中SiVamp71介导的向液泡ROS运输及分布很可能在渗透压胁迫响应过程中发挥关键作用。而SiVamp711仅在控水干旱下上调，SiVamp713在长期控水干旱下转录水平下降，提示SiVamp71基因在维持长期植物干旱胁迫下稳态过程中具体作用不同。SiVamp722、SiVamp725、SiVamp726及SiVamp727在2种胁迫下转录水平变化不同，表明这些基因也可能在渗透压胁迫及干旱胁迫中发挥不同作用。SiVamp725在对照实验中展示出对昼夜时间节律的响应，而在PEG6000模拟渗透压胁迫下其随昼夜节律变化消失，提示渗透压胁迫打破SiVamp725昼夜节律可能是影响并抑制谷子生长机制之一。综上所述，2种胁迫处理对于植物SiVamp7基因转录水平影响不同，在分子生物学水平机制研究中，2种处理不能简单替代。
值得注意的是，PEG模拟胁迫实验采集点为0，12，24 h，而控水干旱检测了胁迫14 d后各植物指标变化。是否PEG处理与控水干旱胁迫植物反应趋势一致，增加PEG处理时间将获得类似控水干旱胁迫的结果？在文献报道PEG模拟干旱实验中，在常见处理浓度(本文10%)下，处理时间通常在24 h以内[4-7]，这与PEG处理带来的渗透压变化迅速而强烈有关。延长PEG处理时间对植物生长甚至存活影响极大。在预实验中，本文尝试延长PEG处理时间，结果在第3～5 d谷子叶片明显变黄萎蔫，部分植物在转回无PEG处理培养液中后也未恢复生长。因此，在现有实验设置下无法获得PEG长期处理样品。是否调整合适的PEG6000处理浓度可以更好地模拟控水干旱过程，值得进一步研究。
植物对干旱胁迫响应是一个复杂的过程，涉及不同的生理过程。为了进一步揭示SiVamp7基因转录水平变化在干旱胁迫响应中的意义，本文选择mbSUS法研究了谷子中广泛表达的钾离子通道SiKAT3与不同SiVAMP7互作情况。在拟南芥中的研究表明，VAMP7蛋白与钾离子通道互作抑制后者活性，影响植物钾吸收及气孔运动[26]。SiKAT3在谷子叶片中表达[47]，与SiKAT3互作的SiVAMP7蛋白很可能通过拟南芥中类似机制影响钾通道功能及气孔运动。结果正如Fig.8所示，SiKAT3与不同SiVAMP7之间存在选择性互作，表明VAMP7-钾通道互作在谷子中也存在。对这一结论的探索，仍需要进一步电生理实验，确认SiKAT3-SiVAMP7蛋白质互作对钾离子通道的活性影响。控水干旱与PEG模拟干旱对SiVamp7基因转录水平影响不同(例如与SiKAT3互作的SiVAMP725及SiVAMP727)，很可能通过影响对钾通道的调控，最终导致植物钾平衡及相关生长及胁迫响应指标区别。特别值得注意的是，在互作蛋白质中，SiVAMP725在PEG处理下时间节律变化被打破，很可能通过进一步改变植物细胞钾吸收时间节律，影响钾平衡，抑制气孔运动及植物生长。
综上所述，针对5个品种谷子对长期控水干旱胁迫及短期PEG渗透压胁迫的响应研究表明，PEG模拟干旱胁迫虽然可以用于初步筛选谷子干旱抗性，但在针对生理水平及分子生物学水平的机制研究中，2种胁迫手段不能简单替换。
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