孟强 张文杰 吴伟康 牛坤伟 杨龙 张玄 陶开山
近年来，终末期肝病和急性肝衰竭患者数量与日俱增，肝移植是最有效的治疗方法。然而，供者器官短缺严重影响了患者的治疗，许多患者在等待移植期间死亡。异种移植是解决器官短缺的有效方法[1-2]。以往研究发现，敲除猪体内主要产生排斥反应的基因[3-4]，可以有效缓解超急性排斥反应[5]，延长受体的生存期，但目前这种方法还不足以用于临床治疗[6-7]。而当体液性排斥反应被减弱后，细胞性排斥反应的表现突显出来。在移植术后的病理组织学研究中发现，异体细胞主要是自然杀伤（natural killer，NK）细胞和巨噬细胞[8-10]，宿主单核细胞和NK细胞是延迟异体移植排斥反应的主要媒介，一旦牢牢黏附在异体移植物的血管内皮上，就能发挥其效应功能，包括产生促进炎症和血栓形成的介质，直接裂解内皮细胞，诱导内皮细胞黏附分子表达[11-12]。
白细胞介素（interleukin，IL）-18是IL-1家族的成员，是一种强大的促炎因子，IL-18凭借其促炎活性和多效性在各种疾病中发挥着重要的病理生理作用[13-15]。在健康人体内，IL-18结合蛋白（binding protein，BP）的血清水平约为IL-18的20倍，与IL-18受体（receptor，R）相比具有非常高的亲和力。IL-18BP能阻断IL-18与IL-18R结合，中和IL-18的生物活性，从而抑制干扰素（interferon，IFN）-γ的产生，限制NK细胞和辅助性T细胞（helper T cell，Th）1的反应[16-17]。在一些疾病模型中，IL-18BP缺陷的小鼠表现出病情加重，用外源性IL-18 BP治疗可有效减轻病理反应[18-20]，在治疗成人斯蒂尔氏病、类风湿性关节炎和斑块状银屑病的临床试验中具有良好的安全性和疗效指征。通过调节IL-18BP水平来减弱IL-18强大的促炎症反应是缓解炎症相关疾病的有效措施[21]。
据研究报道，在体外用人血灌注的猪器官和猪到非人灵长类动物（non-human primate，NHP）的异种移植中发现了NK细胞的浸润[10-13]，表明NK细胞参与了异种移植的排斥反应[22-23]。随后，人们对人NK细胞在异种移植中的作用机制进行了广泛的研究。本研究通过体外实验探讨IL-18/IL-18BP介导NK-92MI细胞杀伤α-1, 3-半乳糖基转移酶（α-1,3-galactosyltransferase，GGTA1）基因敲除（GTKO）猪内皮细胞的效应以及可能的作用机制，旨在为下一步大动物异种移植提供理论基础。
1.1 细胞与试剂
人NK-92MI细胞购自美国ATCC。GTKO猪内皮细胞是从猪动脉血管内皮中提取的原代细胞。
主要试剂包括：重组人IL-18（美国BioLegend公司），重组人IL-18BP（武汉ABclonal公司），脱氧核糖核酸末端转移酶介导的dUTP缺口末端标记（terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling，TUNEL）细胞凋亡检测试剂盒（上海Beyotime公司），乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）细胞杀伤活性试剂盒（美国Promega公司），胎牛血清、青霉素-链霉素溶液及MEMα培养基均购于美国Gibco公司，穿孔素（perforin）单克隆抗体、颗粒酶B（granzyme B）单克隆抗体、IFN-γ单克隆抗体均购于英国Abcam公司，B淋巴细胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）单克隆抗体、Bcl-2相关X蛋白（Bcl2-associated X protein，Bax）单克隆抗体、裂解半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase，cleaved Caspase）-3、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase）-3 单克隆抗体以及辣根过氧化物酶标记二抗均购于美国CST公司。
1.2 细胞培养与分组
NK-92MI细胞在含12.5%马血清、12.5%胎牛血清、0.2 mol/L肌醇、0.1 mol/L β-巯基乙醇、0.02 mol/L叶酸和青霉素或链霉素的MEMα培养基中生长，在37 ℃、5%CO2加湿的空气中培养。GTKO猪内皮细胞在含有10%的胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的内皮细胞培养基中生长，在37 ℃、5% CO2加湿的空气中培养。
细胞分组：将NK-92MI细胞分为NK组、NK+IL-18组、NK+GTKO组、IL-18+NK+GTKO组、IL-18+IL-18BP+NK+GTKO组。NK细胞每组5×105个，GTKO猪内皮细胞每组1×105个，IL-18和IL-18BP在培养基中浓度分别为100 ng/mL和200 ng/mL，在37 ℃、5% CO2加湿的空气中培养48 h后进行后续操作。所有实验均一式3份。
1.3 实验方法
1.3.1 实时定量逆转录聚合酶链反应分析炎症相关基因表达 提取各组NK-92MI细胞的总RNA，采用实时定量逆转录聚合酶链反应（quantitative realtime reverse transcription polymerase chain reaction，qRT-PCR）测定IFN、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α、IL-8、IL-3、IL-6、粒细胞 -巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF）信使核糖核酸（messenger ribonucleic acid，mRNA）的表达水平。
1.3.2 NK-92MI细胞的细胞毒性测定 采用LDH细胞杀伤活性试剂盒测定NK细胞介导的细胞毒性。按照说明进行操作，所有实验重复3次。
1.3.3 TUNEL法检测细胞凋亡 根据试剂盒说明书，用TUNEL细胞凋亡检测试剂盒评估GTKO猪内皮细胞的凋亡情况。凋亡的细胞被染成红色，细胞核被4",6-二脒基-2-苯基吲哚（4", 6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）标记为蓝色。用荧光显微镜观察并拍照。
1.3.4 蛋白质印迹法检测杀伤效应和凋亡相关蛋白表达水平 分别提取不同处理的NK-92MI细胞和GTKO猪内皮细胞中的总蛋白，电泳、转膜后封闭，置于一抗中4 ℃过夜，二抗中室温孵育90 min，冲洗后按照化学发光显色试剂盒说明书进行操作，测定穿孔素、颗粒酶B、IFN-γ、Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表达水平。
1.4 统计学方法
采用GraphPad Prism v8.02进行统计分析并构建图表。符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示，比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法。P<0.05为差异有统计学意义。
2.1 IL-18BP抑制IL-18诱导的NK-92MI细胞中炎症相关基因表达
qRT-PCR结果显示，与NK组比较，NK+IL-18组和NK+GTKO组NK-92MI细胞中炎症相关基因IFN-γ、TNF-α、IL-8、IL-3、IL-6和 GM-CSF 的mRNA表达水平只有轻微的升高，差异均无统计学意义（图1，均为P>0.05）。与NK组、NK+IL-18组以及NK+GTKO组比较，IL-18+NK+GTKO组NK-92MI细胞中 IFN-γ、TNF-α、IL-8、IL-3、IL-6和GM-CSF的mRNA表达水平均升高，差异均有统计学意义（图1，均为P<0.05）。与IL-18+NK+GTKO组比较，IL-18+IL-18BP+NK+GTKO组NK-92MI细胞中 IFN-γ、TNF-α、IL-8、IL-3、IL-6和 GM-CSF的mRNA表达水平均降低，差异均有统计学意义（图1，均为P<0.05）。结果表明IL-18BP能够抑制IL-18诱导的NK-92MI细胞中炎症相关基因的表达。
图1 各组NK-92MI细胞中炎症相关基因的表达Figure 1 Expression of inflammation-related genes of NK-92MI cells in each group
2.2 IL-18BP抑制IL-18诱导的NK-92MI细胞中具有杀伤效应的蛋白表达
蛋白质印迹法结果显示，与NK+GTKO组相比，IL-18+NK+GTKO组NK-92MI细胞中穿孔素、颗粒酶B和IFN-γ蛋白表达水平均升高，差异均有统计学意义（图2，均为P<0.05）。与IL-18+NK+GTKO组比较，IL-18+IL-18BP+NK+GTKO组穿孔素、颗粒酶B、IFN-γ蛋白表达水平均降低，差异均有统计学意义（图2，均为P<0.05）。结果表明IL-18BP能够抑制IL-18诱导的NK-92MI细胞中具有杀伤效应的蛋白表达。
图2 各组NK-92MI细胞中杀伤效应蛋白的表达Figure 2 Expression of killer effector proteins of NK-92MI cells in each group
2.3 IL-18BP抑制IL-18诱导的NK-92MI细胞杀伤GTKO猪内皮细胞的效应
LDH试验结果显示，与NK+GTKO组比较，IL-18+NK+GTKO组NK-92MI细胞对GTKO猪内皮细胞的杀伤率增加，差异有统计学意义（图3A，P<0.05）。与IL-18+NK+GTKO组比较，IL-18+IL-18BP+NK+GTKO组NK-92MI细胞对GTKO猪内皮细胞的杀伤率降低，差异有统计学意义（图3A，P<0.05）。
TUNEL染色结果表明，与NK+GTKO组比较，IL-18+NK+GTKO组中阳性细胞更多，细胞凋亡率增加，差异有统计学意义（图3B、C，P<0.05）。与IL-18+NK+GTKO组比较，IL-18+IL-18BP+NK+GTKO组中阳性细胞减少，细胞凋亡率下降，差异有统计学意义（图3B、C，P<0.05）。
蛋白质印迹法结果显示，与NK+GTKO组比较，IL-18+NK+GTKO组GTKO猪内皮细胞中Bax/Bcl-2和cleaved Caspase-3/ Caspase-3的比例均升高，差异均有统计学意义（图3D～F，均为P<0.05）。与IL-18+NK+GTKO组比较，IL-18+IL-18BP+NK+GTKO组Bax/Bcl-2和cleaved Caspase-3/Caspase-3的比例均下降，差异均有统计学意义（图3D～F，均为P<0.05）。
图3 各组NK-92MI细胞对GTKO猪内皮细胞的杀伤效应Figure 3 Cytotoxic effect of NK-92MI cells on GTKO porcine endothelial cells in each group
由于我国供者的数量远远不能满足需要接受肝移植患者的数量，异种肝移植成为了解决供受体不平衡最有效的手段[24-25]。而异种肝移植术后急性血管性排斥反应仍然是限制供体肝脏存活时间的重要影响因素[26]。笔者在猪-猴异种肝移植研究中发现，NK细胞在急性血管性排斥反应中起着重要的作用[12]，并且IL-18/IL-18BP比例出现明显失衡。给予外源性IL-18BP可以起到治疗的作用，但如果能使供体肝脏自发产生IL-18BP将更好地保护移植肝脏。
当受者的血液进入供者器官后，免疫细胞首先接触到血管内皮细胞并且黏附在上面，进而发生免疫排斥反应，内皮细胞损伤后会释放多种促凝因子富集，形成微血栓，最终导致移植物的失能，因此保护血管内皮细胞是减轻排斥反应的有效措施。
本实验结果显示，经IL-18处理后，人NK-92MI细胞中炎症相关基因IFN-γ、TNF-α、IL-8、IL-3、IL-6和GM-CSF的mRNA表达水平显著升高，在加入IL-18BP后，上述炎症因子的表达明显被抑制，表明IL-18BP的处理能够有效抑制NK-92MI细胞的活化。蛋白质印迹法结果显示，当IL-18BP存在时，NK-92MI细胞产生的穿孔素、颗粒酶B和IFN-γ显著减少，表明IL-18BP能够抑制IL-18诱导的NK-92MI细胞中具有杀伤效应的蛋白表达。
细胞杀伤实验和TUNEL结果表明，在加入外源性IL-18BP后NK-92MI细胞对GTKO猪内皮细胞的杀伤效应明显减弱。Bcl-2家族在细胞凋亡中发挥重要的生理作用，主要通过作用于线粒体，调节细胞膜通道导致细胞凋亡。Bax和Bcl-2均为Bcl-2家族的成员，其中Bax 是促进肿瘤细胞凋亡的关键蛋白，而Bcl-2是保护肿瘤细胞的关键蛋白，可抑制肿瘤细胞发生凋亡[27]。除了Bcl-2家族外，Caspase家族蛋白的活化同样是细胞凋亡发生的特征，其中Caspase-3可激活凋亡信号的传递，活化形式的cleaved Capase-3是发挥功能的亚单位，促进细胞凋亡[28]。Bax和Bcl-2结合可形成凋亡二聚体，促进凋亡诱导因子的释放，与Caspase蛋白级联反应，诱导细胞凋亡[29-30]。蛋白质印迹法结果显示，IL-18激活的NK-92MI细胞能够上调GTKO猪内皮细胞中Bax/Bcl-2和cleaved Caspase-3/ Caspase-3的比例，而加入IL-18BP后GTKO猪内皮细胞中Bax/Bcl-2和cleaved Caspase-3/Caspase-3的比例明显降低，说明IL-18BP可抑制IL-18激活的NK-92MI细胞杀伤GTKO猪内皮细胞的效应。
综上所述，本研究表明IL-18BP可阻断IL-18诱导的NK-92MI细胞中炎症相关基因表达和NK-92MI细胞杀伤GTKO猪内皮细胞的效应。如何在不加入外源性IL-18BP的情况下，维持IL-18BP与IL-18的平衡，减轻异种移植物的免疫排斥反应有待进一步深入探索研究。
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