杨梦思，张 丽，胡宪文
脑卒中或心脏骤停常导致缺氧缺血性神经损伤。脑缺氧/复氧(cerebral hypoxia/reoxygenation，H/R)损伤的病理生理机制十分复杂，包括ATP丧失、自由基产生和细胞死亡等[1]。因此，探讨H/R损伤的作用机制至关重要。
磷酸酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B/糖原合成酶激酶3β(phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B/glycogen synthase kinase-3beta,PI3K/Akt/GSK-3β)通路是参与调节神经元凋亡[2]的重要信号机制。GSK-3β特异性抑制剂4-苄基-2-甲基-1,2,4-噻二唑烷-3,5-二酮(4-benzyl-2-methyl-1,2,4-thiadiaz olidine-3,5-dione，TDZD-8)预处理可显著改善缺氧脑损伤[3]。细胞骨架是维持神经细胞形态结构的重要基础，当受到应激等相关刺激时随之改变[4]。微管是其组成基础，微管相关蛋白2(microtube associated protein 2，MAP2)能够调控神经元微管结构的稳定性。研究[5]表明，GSK-3β的失活会导致MAP2磷酸化减少，并增加微管的结合和稳定性。然而GSK-3β对下游微管蛋白MAP2的调节是否参与了H/R损伤机制尚未见报道。该研究利用TDZD-8研究斑马鱼H/R模型中GSK-3β的作用及其对MAP2蛋白的影响，以探究H/R损伤的机制。
1.1 材料
1.1.1实验动物 斑马鱼由中国科技大学实验室提供，安徽医科大学第二附属医院麻醉科实验室饲养。控制温度为28.5 ℃，光照/黑暗为12 h ∶12 h交替循环。许可证号：USTCACUC1103013。
1.1.2主要试剂 氯化三苯基四氮唑(2、3、5-triphenyte-trazoliumchloride，TTC)购自美国Sigma公司；
TUNEL凋亡试剂盒、提取RNA试剂盒、逆转录试剂盒、高特异性染料法定量PCR检测试剂盒购自南京Vazyme公司；
引物和蛋白提取试剂盒购自上海Sangon Biotech公司；
BCA蛋白浓度测定试剂盒购自上海Beyotime公司；
GAPDH、GSK-3β、MAP2 Western blot抗体购自武汉preoteintech公司；
Hif-1α抗体购自美国Novus Biologicals公司；
p-GSK-3β、MAP2免疫荧光染色抗体购自美国SANTA CRUZ公司。
1.1.3主要仪器 溶氧仪(上海仪电科学仪器股份有限公司)，倒置荧光显微镜(Carl Zeiss公司)，PCR仪(伯乐BIO-RAD生命医学产品有限公司)，细胞破碎仪(上海净信实业发展有限公司)，多功能酶标仪(Thermo Fisher Scientific公司)，凝胶成像系统(上海天能科技有限公司)，冰冻切片机(赛默飞世尔上海仪器有限公司)。
1.2 方法
1.2.1斑马鱼急性缺氧模型 通过注入高纯氮气(纯度为99.99%)去除养鱼水中的溶解氧，用溶氧仪测量水中溶氧量水平至0.3 g/L以下[6]，迅速将斑马鱼放入水中，持续监测养鱼水中溶氧水平，创造一个封闭的缺氧环境进行急性缺氧。鱼的缺氧状态分为第一阶段(在水面游动)、第二阶段(不能采取正常姿势)、第三阶段(鳃盖短暂不规律的搏动)和第四阶段(身体扭曲死亡)[1]。当缺氧斑马鱼达到第三阶段1 min时，迅速将斑马鱼从缺氧环境中取出，置于常氧环境中复氧6 h后进行下一步实验操作。
1.2.2实验分组 随机取健康同等体型成鱼每组各6条，分为对照(Control)组、缺氧/复氧(H/R)组、缺氧/复氧+GSK-3β抑制剂(H/R+TDZD-8)组进行实验。其中Control组不做任何处理，H/R组在急性缺氧后转移至正常养鱼水中进行6 h的复氧，H/R+TDZD-8组斑马鱼则预先放入含有浓度为1 μmol/L TDZD-8的养鱼水中4 h，再用养鱼水或PBS清洗5 min后,进行缺氧/复氧造模，而后在复氧时间终点进行取材。
1.2.3TTC染色检测脑梗死面积 将斑马鱼用MS-222进行麻醉，在显微镜下用眼科镊取出脑组织，进行新鲜脑组织切片，将其切为1 mm厚度的薄片，避光置于2%的TTC溶液之中室温染色40 min，染色后将脑片取出置于4%的多聚甲醛溶液中终止染色并固定，用显微镜进行拍照。
1.2.4TUNEL染色检测细胞凋亡 麻醉后取成鱼脑组织于4%多聚甲醛固定过夜，使用20%～30%的蔗糖溶液脱水48 h后进行冰冻切片，厚度为10 μm。取各组切片用PBS洗涤2次，每次5 min。加入含0.5% Triton X-100的PBS，室温孵育5 min，PBS洗涤2次，每次5 min。参照TUNEL试剂盒使用说明，每个样本上滴加50 μl TUNEL检测液，湿盒内37 ℃避光孵育60 min，PBS洗涤3次。待玻片干后，在每个样品中加入含抗荧光淬灭DAPI各50 μl，封片后荧光显微镜观察。各组切片取中脑视顶盖，在荧光显微镜下放大200倍观察，统计视野内绿色荧光点和蓝色荧光点的数目，计算细胞凋亡率 = (绿色荧光细胞/蓝色荧光细胞)×100%。
1.2.5qRT-PCR 各组斑马鱼到达时间点后用MS-222麻醉，按照RNA提取试剂盒步骤提取脑组织RNA，应用逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA。将cDNA按照SYBR qPCR SuperMix试剂盒步骤进行荧光定量PCR，每组设置3个复孔，采用相对定量法进行分析，计算出2-ΔΔCT进行数据统计。β-actin 上游引物为：
5′-CCCTGTTCCAGCCATCCTT-3′，下游引物为：
5′-TTGAAAGTGGTCTCGTGGATACC-3′；
Hif-1αa 上游引物为：5′-CCAGTGGAACCAGACATCAG-3′，下游引物为：5′-AGGAGGGTAAGGGTTGGAAT-3′；
Hif-1αb 上游引物为：
5′-ATGAGAGGGAGTTGCTAGATTC-3′，下游引物为：5′-AGGAGGGTAAGGGTTGGAAT-3′。
1.2.6Western blot 取脑组织放入研磨管中，预冷PBS冲洗，加入蛋白提取试剂盒内配制好的裂解液，在全自动样品快速研磨仪中60 Hz研磨60 s。将匀浆液置于冰上放置40 min，4 ℃条件下12 000 r/min离心10 min，取上清液即为全蛋白，置于-80 ℃保存备用。使用BCA蛋白定量试剂盒在酶标仪内测定562 nm处各组蛋白光密度(optical density, OD)值，绘制标准蛋白曲线，进行蛋白定量。上样缓冲液 ∶全蛋白提取液按体积比1 ∶4混匀，100 ℃煮10 min。室温冷却后置于-20 ℃保存。取20 μg蛋白样品，8%SDS-PAGE凝胶电泳，浓缩胶为70 V、30 min，分离胶为100 V、90 min。转移至PVDF膜，200 mA恒流300 min。置于快速封闭液中室温下封闭15 min。一抗4 ℃摇床孵育过夜,分别为GAPDH(1 ∶80 000)、Hif-1α(1 ∶1 000)、GSK-3β(1 ∶4 000)、p-GSK-3β(Ser9)(1 ∶1 000)、MAP2(1 ∶1 000)。TBST清洗10 min，共3次，将条带置于室温下孵育相对应的二抗，山羊抗兔IgG(1 ∶10 000)或山羊抗鼠IgG(1 ∶10 000)室温孵育60 min。凝胶成像系统显影，Image J软件计算蛋白条带灰度值。
1.2.7免疫荧光染色 取冰冻脑组织切片PBS清洗3次，每次5 min。0.3%Triton X-100的PBS溶液通透60 min。5%BSA溶液封闭30 min。免疫荧光染色一抗MAP2(1 ∶500)4 ℃孵育过夜。绿色荧光二抗(1 ∶500)室温避光孵育1 h。样本上滴加适量DAPI与抗荧光淬灭封片液封片。各组切片取中脑视顶盖区域,荧光显微镜下放大200倍观察后拍照， 使用Image J软件测定荧光强度。
2.1 斑马鱼急性缺氧模型的构建及鉴定与Control组相比，缺氧2 h/复氧3 h、6 h、24 h后缺氧诱导因子Hif-1αa和Hif-1αb的mRNA均升高，其中复氧6 h后mRNA升高最为显著(F=10.78，P<0.01)，本研究选择复氧6 h组进行Hif-1α蛋白的检测，结果显示Hif-1α蛋白表达量增加(t=4.780，P<0.01)，因此，后续实验复氧时间均选择6 h作为复氧终点。见图1。
图1 斑马鱼急性缺氧模型建立
2.2 TDZD-8对H/R斑马鱼脑组织梗死面积的影响TTC染色结果显示，与Control组相比，H/R组的白色梗死区域增多(F=28.77，P<0.01)；
与H/R组相比，H/R+TDZD-8组梗死区域减少(F=26.91，P<0.01)。见图2。
2.3 TDZD-8对H/R斑马鱼神经细胞凋亡的影响TUNEL染色检测结果显示，斑马鱼中脑视顶盖小球周灰质带(periglomerular gray zone，PGZ)区域有多层紧密的神经细胞核排列，选择此区域进行TUNEL染色观察。与Control组相比，H/R组细胞凋亡率升高(F=25.14，P<0.01)；
与H/R组相比，H/R+TDZD-8组细胞凋亡率下降(F=22.79，P<0.01)。见图3。
图2 斑马鱼脑梗死面积
2.4 TDZD-8对H/R斑马鱼脑组织中p-GSK-3β/GSK-3β、MAP2蛋白表达量的影响Western blot检测结果显示，各组GSK-3β蛋白水平无显著差异；
与Control组相比，H/R组p-GSK-3β(Ser 9)/GSK-3β比值降低(F=9.103，P<0.01)，MAP2蛋白水平降低(F=3.709，P<0.05)；
与H/R组相比，H/R+TDZD-8组的p-GSK-3β(Ser 9) / GSK-3β比值升高(F=6.562，P<0.01)，MAP2表达量增加(F=4.934，P<0.01)，表明TDZD-8预处理能够改善斑马鱼脑缺氧/复氧导致的p-GSK-3β(Ser 9)以及MAP2蛋白的表达减少。见图4。
2.5 TDZD-8对H/R斑马鱼脑组织MAP2的分布与表达的影响免疫荧光染色结果显示，斑马鱼中脑视顶盖边缘层(stratum marginale，SM)及中央层(stratum centrale，SC)神经细胞分布较少，其内有许多神经纤维穿过，故在此区域观察MAP2的荧光表达与分布。与Control组和H/R+TDZD-8组相比，H/R组MAP2荧光分布和表达减少(F=10.70，P<0.01；
F=6.788，P<0.01)。见图5。
图3 斑马鱼神经元凋亡
脑缺氧/缺血可引发组织梗死，因为缺氧和能量剥夺会在数分钟内造成神经元的结构损伤，导致神经细胞凋亡和坏死[7]。斑马鱼和人类之间高度的遗传同源性，及其光学透明度高的特性，使得斑马鱼在研究缺血/再灌注或缺氧/复氧损伤的脑血管病理机制上具备优越性，这将有助于更好地了解人类脑血管疾病的病因机制，以取得新的治疗进展[8]。Sawahata et al[9]的研究显示，采用缺氧再氧处理构建的斑马鱼脑缺氧模型已被证实具有诱导脑缺血再灌注的作用，其机制是由于持续的缺氧加重了心脏负荷，导致血液循环恶化，造成中脑中央动脉供血不足而引起血流中断，而复氧引起的血管收缩则能够改善脑血管血流中断的情况。缺氧诱导因子1是细胞对缺氧应激反应的主要调节因子，Hif-1α通过基因复制产生两组同源物分别为Hif-1αa和Hif-1αb，因此本研究选择Hif-1αa和Hif-1αb检测mRNA的表达，然后使用Western blot检测Hif-1α进行进一步验证。本研究中，H/R斑马鱼脑组织TTC染色中的白色梗死面积的增加证明H/R造模成功中断了脑血流灌注，TUNEL染色中H/R组斑马鱼脑组织中的凋亡细胞增多也表明H/R诱导了斑马鱼神经元凋亡，说明斑马鱼脑缺氧/复氧损伤模型构建成功。
PI3K/Akt途径是H/R损伤后的神经细胞存活主要通路之一[10]。GSK-3β是Akt的下游靶点，通过磷酸化Akt的激活而受到抑制[11]。本研究结果显示，中枢神经系统中GSK-3β的Ser9位点磷酸化因H/R损伤而减少，导致缺氧引起的神经元死亡，这与先前的研究[12]结果一致。MAP2是调节微管动态组装特性的一类细胞骨架蛋白，其在缺血和代谢受到损害后发生降解[13]，但这种降解的时间过程和初始触发因素尚不完全清楚。本研究结果显示，H/R导致p-GSK-3β / GSK-3β比值下降，MAP2蛋白与免疫荧光表达均降低。免疫荧光结果显示，MAP2主要分布于斑马鱼中脑视顶盖外缘层及中央层，其内主要为神经纤维，用于维持微管稳定。MAP2蛋白表达量在H/R后出现下降。为进一步阐明MAP2的降解与GSK-3β的关系，本研究使用了高选择性GSK-3β抑制剂TDZD-8进行预处理。结果证明，TDZD-8在不影响其他激酶的情况下，可选择性地激活GSK-3β的Ser9位点磷酸化从而抑制GSK-3β的活性[14]，并能保护大脑免受缺血/再灌注损伤[15]。本研究实验结果表明，TDZD-8预处理能够减轻斑马鱼H/R损伤造成的脑梗死和神经细胞凋亡，提高斑马鱼脑组织中的p-GSK-3β/GSK-3β的比值以及MAP2蛋白和荧光的表达。上述研究结果提示斑马鱼H/R导致的脑损伤可能是由于缺氧/复氧抑制了GSK-3β在Ser9位点的磷酸化而使其活化，促进了MAP2蛋白的降解造成神经元微管稳态失衡，最终导致神经元凋亡。
综上所述，GSK-3β参与了斑马鱼H/R损伤的神经机制，并且与MAP2存在相关性， TDZD-8通过抑制GSK-3β活性减少MAP2的降解，从而减少脑梗死面积及神经元凋亡，最终有效改善脑缺氧/复氧损伤。但该研究的局限性在于并没有进一步证明GSK-3β对MAP2磷酸化的调节作用，以及干扰MAP2表达后对GSK-3β及H/R损伤的影响，需进一步深入研究其具体机制，为保护脑缺氧/复氧造成的神经损伤提供一种新思路。
图4 p-GSK-3β / GSK-3β和MAP2蛋白相对表达
图5 免疫荧光检测各组MAP2的分布与表达
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