董亚蕾 ,乔亚森 ,牛水蛟 ,王海燕* ,孙 磊 ,路 勇
(1.中国食品药品检定研究院 国家药品监督管理局化妆品研究与评价重点实验室,北京 100050;2.山东省食品药品检验研究院,济南 250101)
近几年,脱发人数迅速增加,以植物为原料开发的防脱发化妆品的消费需求日益旺盛[1-3]。据统计,国产防脱发化妆品涉及154种植物,其中侧柏叶、何首乌、姜、人参、当归等被高频使用[4],植物类防脱发化妆品已成为国产化妆品的重要组成部分。植物原料成分复杂,其中一些风险物质[5],如重金属、光敏性物质、农药等也会随之进入到化妆品中。防脱发化妆品直接接触人体皮肤表面,其中的农药残留可能会对人体健康造成安全隐患。目前关于农药残留检测的研究主要集中在食品[6]、中药材[7]、环境[8]、生物样本[9]等领域。化妆品中农药残留检测方面的研究工作和涉及的农药种类较少,且尚未对植物类防脱发化妆品中的农药残留情况进行筛查和评估[10-12]。因此,建立植物类防脱发化妆品中农药残留的高通量检测方法,对该类化妆品中农药残留的赋存状态和危害性评估具有重要意义。
超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱法(UHPLC-Q-TOF-MS)是一种高分辨质谱法,对前端分离要求低,能够获得母离子和碎片离子的精确质量数,通过建立数据库实现筛查功能,从而达到更高的质量精度和更强的检测通量,是化妆品中限用组分、非法添加化合物筛查确证的强有力工具[13]。文献[14]采用固相萃取-UHPLC-Q-TOF-MS对植物类防脱发化妆品中人参和甘草类功效成分进行了确证;文献[15]采用UHPLC-Q-TOF-MS,实现了防脱发化妆品中多种非法添加化合物的检测。因此,本工作采用UHPLC-Q-TOF-MS获得203 种农药的保留时间、一级母离子和二级子离子精确质量数及丰度比等信息,利用UNIFI软件构建203种农药的数据库,并将该数据库用于市售植物类防脱发化妆品中农药残留的筛查,以期为植物类防脱发化妆品中农药残留的分析提供更高效的检测方法。
1.1 仪器与试剂
ACQUITY UPLC I Class型超高效液相色谱仪;Xevo G2-XS TOF型飞行时间高分辨质谱仪,配UNIFI科学信息管理系统;G10型离心机;Vortex-5型涡旋振荡器;KQ-700DE 型超声波清洗器;AL 204型电子天平。
203种农药单标准溶液:100 mg·L-1,溶剂为甲醇或乙腈。
1 mol·L-1乙酸铵-乙酸缓冲溶液(pH 5.0):取适量乙酸铵,用水溶解,并用乙酸调节溶液酸度至pH 5.0,配制成1 mol·L-1乙酸铵-乙酸缓冲溶液。使用时,分别用水或甲醇稀释100 倍,得到流动相A、B。
甲醇、乙腈、乙酸、乙酸铵均为质谱纯。
植物类防脱发化妆品共24批,包含育发液、育发剂、精华液、营养液、滋养液等,均为特殊用途化妆品,购自电商平台、商场、专卖店等,外包装标识具有防脱发、育发等功效,且配方中含有多种植物提取物。
1.2 仪器工作条件
1.2.1 色谱条件
ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(100 mm×2.1 mm,1.7μm);柱温40 ℃;进样量5μL;流动相A 为10 mmol·L-1乙 酸铵-乙酸缓冲 溶液(pH 5.0),流动相B 为含10 mmol·L-1乙酸铵-乙酸的甲醇溶液(pH 5.0);流量0.45 mL·min-1。梯度洗脱程序:0～0.25 min时,B为2%;0.25～12.25 min时,B 由2%升至99%,保 持0.75 min;13.00～13.01 min,B由99%跳转至2%,保持3.99 min。
1.2.2 质谱条件
电喷雾离子源,正、负离子(ESI＋、ESI-)模式电离;离子源温度120 ℃;毛细管电压1.0 kV,采样锥电压20.0 V;脱溶剂气温度550 ℃,脱溶剂气流量1 000 L·h-1;锥孔气流量50 L·h-1;全信息串联质谱(MSE)模式扫描;低碰撞能量4 e V,高碰撞能量10～45 e V;实时校正液采用亮氨酸脑啡肽溶液(200μg·L-1),ESI＋模式下的精确质量数为质荷比(m/z)556.277 1,ESI-模式下的精确质量数为m/z554.261 5。
1.3 试验方法
1.3.1 203种农药筛查数据库的建立
以甲醇或乙腈为溶剂,将203种农药单标准溶液质量浓度均稀释至50μg·L-1,按照仪器工作条件进行测定,获得各农药的母离子和所有子离子m/z及丰度比等质谱数据,将各农药的保留时间和质谱数据导入UNIFI软件中[16],构建筛查数据库。表1中列出了203 种农药的名称、分子式、保留时间、母离子和子离子m/z及电离模式。
表1 203种农药筛查数据库信息Tab.1 Database information of 203 pesticides for screening
表1 (续)
表1 (续)
表1 (续)
表1 (续)
1.3.2 样品分析
称取样品0.2 g于10 mL离心管中,加入8 mL甲醇,充分涡旋分散后用甲醇定容。超声提取10 min,静置至室温后以10 000 r·min-1转速离心5 min。取上清液,经0.22μm 微孔滤膜过滤,取滤液待测。在MSE扫描模式下,分别采集样品在ESI＋、ESI-电离模式下的高分辨质谱数据。
将24批样品的高分辨质谱数据导入UNIFI软件,利用建立的数据库和分析方法对203种农药进行定性筛查和确证。筛查条件如下:设置保留时间绝对偏差的绝对值在0.2 min内,母离子和子离子m/z相对偏差的绝对值小于5×10-6,响应强度大于500,至少检测1个母离子和1个子离子。
2.1 防脱发化妆品类型的选择
市售的防脱发化妆品一般包括两种类型:一类是育发液、育发剂、精华液、营养液等液体化妆品,质地较为稀薄,多是各种植物提取物的混合物,使用时涂抹于头皮直至完全吸收,在皮肤表面停留时间长,属于驻留型化妆品;另一类是宣称具有防脱发效果的洗发水、洗发露、护发素等膏霜乳化妆品,质地厚重,配方复杂,含有大量的表面活性剂、发用调理剂、增稠剂,以及一部分植物提取物作为育发功效成分,使用后需用清水冲洗干净,在皮肤表面停留时间较短,属于淋洗类化妆品。这两种类型产品相比,液体化妆品中植物提取物的种类更多、配方比例更高,且需要停留在皮肤表面直至完全吸收,其中植物原料所含有的风险物质可能对人体产生的危害更大。因此,为筛查防脱发化妆品中农药残留的情况,试验以液体化妆品为研究对象,对提取溶剂和色谱条件进行优化。
2.2 提取溶剂的选择
以育发液为代表性基质,考察了甲醇和乙腈两种常用有机溶剂对该类样品中农药的提取效果。结果表明:以甲醇为提取溶剂时,大部分农药的峰形较好,这可能是由于这类产品通常是多种植物原料的乙醇提取物,性状较为均一;以乙腈为提取溶剂时,虽然大部分农药的提取效果也可以满足要求,但部分农药的提取效果不佳,如四螨嗪、氟啶胺、咯菌腈和猛杀威等农药的提取率为60.0%左右,联苯肼酯的提取率仅27.3%。为兼顾方法的通用性,试验选择的提取溶剂为甲醇。
2.3 色谱条件的选择
由于本方法涉及的农药种类较多,性质差异大,在流动相中加入添加剂可改善各目标物的分离情况。试验发现,以10 mmol·L-1乙酸铵-乙酸缓冲溶液(pH 5.0)为添加剂时,组成的缓冲体系有利于农药在流动相中保持稳定的电离状态,从而获得稳定的保留时间,并且该体系对ESI＋、ESI-电离模式的目标物均适用。因此,试验选择在水相和有机相中添加10 mmol·L-1乙酸铵-乙酸缓冲溶液(pH 5.0)。
试验进一步考察了进样量分别为2,5,10μL时对各农药色谱峰的影响。结果表明:进样量由2μL增大至5μL时,大部分农药色谱峰响应值增大的同时,还能够保持较好的峰形,见图1(a);但进样量继续增大至10μL时,部分农药溶剂效应显著增加,如丙溴磷、甲基嘧啶磷、甲氰菊酯和三唑酮等出现了明显的峰前延现象,见图1(b)。为兼顾大部分农药的灵敏度和分辨率,试验选择的进样量为5μL。
图1 进样量对丙溴磷、甲基嘧啶磷、甲氰菊酯、三唑酮色谱峰的影响Fig.1 Effects of the injection volume on the chromatographic peaks of profenofos,pirimiphos-methyl,fenpropathrin and triadimefon
2.4 筛查条件的选择
欧盟准则2002/657/ECCommission Decision of12August2002ImplementingCouncilDirective96/23/EC Concerning the Performance of AnalyticalMethodsandtheInterpretationofResults要求禁用物质的确证必须达到4个识别点,规定高分辨质谱中每个母离子的识别点为2.0,子离子的识别点为2.5。因此,利用UHPLC-Q-TOFMS,只需1个母离子和1个子离子即可完成对目标物的确证,具体筛查条件见1.3.2节。
2.5 样品分析
按照试验方法对24批样品进行分析,所得质谱数据导入UNIFI软件,利用建立的数据库对203种农药进行筛查和确证。结果发现:有1批样品(发根营养液)中某一化合物的保留时间为8.34 min,与数据库中嘧菌酯的保留时间相差0.03 min;低能量通道中存在m/z404.123 8,对应嘧菌酯的[M＋H]＋;高能量通道中既存在嘧菌酯的母离子m/z404.123 7,又存在 子离子m/z372.098 2、m/z344.103 8和m/z329.080 7(图2),与数据库中嘧菌酯的子离子m/z和丰度比基本一致,满足筛查条件,因此确证该样品中检出嘧菌酯。这是首次在防脱发化妆品中检出嘧菌酯,目前尚未有测定化妆品中嘧菌酯含量的方法,需要采用三重四极杆质谱法进行嘧菌酯的定量分析,且关于嘧菌酯的来源,及其在化妆品中是否普遍存在等问题,仍需要进一步研究。
图2 标准溶液和阳性样品中嘧菌酯的低能量质谱图和高能量质谱图Fig.2 MS spectra of azoxystrobin in standard solution and positive sample with low energy and high energy
本工作采用UHPLC-Q-TOF-MS,结合各农药的高分辨质谱信息,构建了203种农药数据库,并用于24批植物类防脱发化妆品中农药残留的筛查。该方法前处理方式简单,筛查结果准确,且筛查数据库能够用于持续监测该类型产品中的农药残留情况,可作为防脱发化妆品中新风险物质发现识别的有力技术工具,为防脱发化妆品的安全监管提供技术支撑。
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