李婷婷，夏枫峰，油九菊，张平平，张祯祺，张向东，宋怀颖，蔡惠文，施 慧
（1.浙江海洋大学国家海洋设施养殖工程技术研究中心，浙江舟山 316022；
2.舟山市海洋与渔业局，浙江舟山 316000；
3.浙江海洋大学海洋科学与技术学院，浙江舟山 316022；
4.浙江海洋大学海洋与渔业研究所，浙江省海洋水产研究所，浙江舟山 316021）
凡纳滨对虾Litopenaeus vannamei，又名南美白对虾，因其具有饵料需求低、抗病性强、适应性强、营养价值高、经济价值高等优点，在水产品市场占有重要地位[1]。肠道是对虾营养物质消化吸收的重要器官，对虾肠道微生物群落在宿主营养代谢、免疫防御和生长发育起着关键作用[2]。因此，凡纳滨对虾肠道微生物在对虾生产和疾病预防等方面的研究越来越多。
GUO Haipeng,et al[3]发现对虾肠道有益菌增加会促进对虾生长。HOSSAIN,et al[4]发现健康和受感染的对虾在肠道菌群组成和丰度存在显著差异。FRANK,et al[5]认为肠道细菌的失衡可能引起肠炎。核心微生物是影响对虾肠道微生物结构和功能的关键因素。XIONG Jinbo,et al[6]发现对虾肠道有益核心微生物组是红杆菌科和黄杆菌科。YAO Zhiyuan,et al[7]发现健康对虾肠道核心微生物是红杆菌科，患病对虾肠道核心微生物是弧菌科。吴金凤等[8]从对虾肠道中选出61 种指示物种来区分对虾的健康状态。
目前在对虾肠道微生物群落结构与对虾生长关系的研究中，大部分集中在对虾健康与疾病方面，而有关对虾产量和肌肉品质方面的研究鲜有报道，且对虾肠道微生物群落结构中关键微生物的种类和功能尚待挖掘。高通量测序技术[9]能够可靠、全面地反映微生物群落组成基本特征，因此本研究采用高通量测序技术，对对虾肠道的微生物群落结构进行分析，探讨生态基[10]和净水剂“格义净”在调节对虾养殖环境，优化凡纳滨对虾肠道微生物群落结构中的作用，分析凡纳滨对虾肠道微生物群落结构对对虾生长、肌肉品质的具体影响，从而为提高凡纳滨对虾养殖产量和质量提供理论依据。
1.1 养殖管理与实验设计
本研究在舟山市某水产养殖场开展，该养殖场单个实验养殖塘面积9 m2，深度0.9 m，进水符合对虾养殖技术规范水质要求，且增氧设施及排水系统完备。实验时间为2021 年8 月1 日—2021 年10 月30 日，养殖周期为90 d，分为3 个阶段：0～30 d 为养殖前期、30～60 d 为养殖中期、60～90 d 为养殖后期。养殖水温为25～31 ℃，盐度为26～30，pH 为7.6～8.6，溶解氧为4.37～7.14 mg·L-1。虾苗初始体长2.92±0.04 cm、初始体重0.23±0.004 g，养殖密度为667 尾·m-2。每天进行4 次饵料投喂（06:00、10:00、14:00、18:00）和1 次排换水（05:00），及时记录饲料投喂量，并随时观察对虾生长状况。
实验设计：本实验共设1 个对照组和3 个实验组，其中每个组设置2 个平行。对照组C 以传统养殖方式进行管理：养殖前中期每隔5 d 投放3 mg·L-1EM 菌和微藻膏，养殖后期每隔3 d 投放3 mg·L-1EM 菌和微藻膏。实验组B 相较于C 组减半投放EM 菌和微藻膏，同时在养殖池底部布设生态基。生态基通过系附坠石均匀得分布在池底，密度为0.18 m·2m-3。实验组P 在养殖过程中投加净水剂“格义净”，即养殖前中期每隔5 d 投放0.2 mg·L-1格义净（1.8 g），养殖后期每隔3 d 投放0.2 mg·L-1格义净（1.8 g）。实验组D 除了按照P 组的方法投放净水剂外，同时在池底部布设生态基，密度为0.18 m·2m-3。
1.2 样品采集与指标测定
1.2.1 样品采集
（1）对虾采集：于养殖实验开始和结束后，每组随机捞取50 尾对虾称重。实验结束后每组随机捞取1 kg对虾进行肌肉营养成分测定，最后各组捞出全部对虾统计对虾产量。
（2）微生物采集：养殖结束前5 d，每天每组随机捞取20 尾对虾，在无菌条件下取对虾肠道及内容物。每天从B 组养殖试验池剪取生态基（0.004 5 m2），在无菌条件下震荡富集微生物滤膜，微生物样品均放-80 ℃冰箱冷冻保存，待进行16S rDNA 测序。
1.2.2 指标测定
（1）对虾生长指标测定
根据实验测得的各组对虾的初始和末尾平均体质量，计算对虾增重率（weight gain rate,WGR），特定生长率（specific growth rate,SGR），饵料系数（feed conversion rate,FCR），存活率（survival rate,SR），并统计各组对虾产量（yield,Y）。公式见（1）-（4）:
式中：W0为对虾初均重，g；
W1为对虾末均重，g；
t 为实验天数，d；
F 为饲料投喂总量，g；
Wt0为对虾初总重，g；
Wt1为对虾末总重，g；
a 为对虾初尾数，ind.；
b 为对虾末尾数，ind.。
（2）对虾肌肉指标测定
将各组对虾甲壳剥离，肌肉捣碎、打浆混合，105 ℃烘干至恒重，采用《食品安全国家标准》[11]方法测定对虾肌肉中一般营养成分（水分、粗灰分、粗蛋白、粗脂肪）、氨基酸组成、脂肪酸组成。
（3）高通量测序及序列分析
提取对虾肠道和生态基微生物总DNA，以16S rDNA 基因V3+V4 区引物扩增DNA，采用Illumina MiSeq 测序平台对扩增产物进行测序。用Vsearch 软件[12]，按照97%相似度将有效序列进行OTU（operational taxonomic unit）聚类，分别从门（Phylum）、属（Genus）分类水平上统计各样本微生物群落组成及相对丰度。采用mothur 软件，基于OTU 数目计算Chao1[13]、Shannon、Simpson[14]、Coverage[15]等多样性指数，用R 软件绘制稀释曲线和PCA 图。
1.3 数据统计与分析方法
通过SPSS 26.0 统计软件对对虾生长指标、微生物组成相对丰度、Alpha 多样性指数等数据进行单因素方差分析（One-Way ANOVA），试验数据用平均值±标准差（mean±SD）表示。在满足方差齐性的条件下对数据进行Turkey 多重比较，若不满足方差齐性，则采用Dunnett-T3 检验法对数据进行多重差异性比较，P＜0.05 表示差异显著。
2.1 对虾生长状况
研究发现不同处理组凡纳滨对虾生长状况具有差异（表1）。实验组对虾增重率和特定生长率均高于C组，B、D 组产量均高于C 组，饵料系数均低于C 组。其中，B 组的对虾增重率、特定生长率以及总产量最高，分别比C 组提高11.22%、2.80%、2.45%，且B、D 组的饵料系数最低，较C 组降2.27%。
表1 不同处理组凡纳滨对虾生长状况Tab.1 Growth status of L.vannamei in different treatment groups
2.2 对虾肌肉营养组成
对虾肌肉中的蛋白质和脂肪含量是评价虾类营养价值的重要指标[16]。为了进一步评估不同处理组对虾肌肉品质和营养价值，分别对对虾肌肉氨基酸和脂肪酸组成进行了详细分析。
2.2.1 氨基酸组成
氨基酸是构成蛋白质的基本单位，氨基酸的种类和含量决定对虾类肌肉营养价值和鲜味程度[17]。不同处理组对虾肌肉中氨基酸组成相同，但含量不同（表2）。B 组对虾肌肉中总氨基酸总量（ΣTAA）、必需氨基酸总量（ΣEAA）、非必需氨基酸总量（ΣNEAA）、鲜味氨基酸总量（ΣDAA）均高于其他组，具体表现在赖氨酸（6.44%）、苯丙氨酸（3.62%）、苏氨酸（3.39%）、缬氨酸（3.24%）等必需氨基酸，以及谷氨酸（14.82%）、天门冬氨酸（9.10%）、甘氨酸（9.01%）、丙氨酸（5.35%）等鲜味氨基酸含量最高。本研究结果表明B 组对虾肌肉中营养价值和鲜味最高。
表2 不同处理组凡纳滨对虾肌肉中的氨基酸含量（%）Tab.2 Amino acid content in L.vannamei muscle in different treatment groups（%）
2.2.2 脂肪酸组成
脂肪酸是细胞膜的主要组成部分，脂肪酸的种类和含量对对虾肌肉营养价值和鲜味多汁性具有决定性意义。不同处理组对虾肌肉中脂肪酸组成相同，但含量有差异（表3）。B 组对虾肌肉中总n-3 多不饱和脂肪酸含量（25.21%）最高，具体包括EPA（12.67%）、EPA+DHA（24.27%）等含量高于其他组。P 组总n-6 多不饱和脂肪酸含量（24.83%）最高，具体包括亚油酸（22.33%）、花生三烯酸（1.69%）、花生四烯酸（2.51%）等含量高于其他组。本研究结果表明实验组对虾肌肉营养价值和鲜味多汁性高于C 组。
表3 不同处理组凡纳滨对虾肌肉中脂肪酸含量（%）Tab.3 Fatty acid content in L.vannamei muscle in different treatment groups（%）
2.3 微生物群落结构特征
肠道微生物群落结构与凡纳滨对虾生长密切相关[18]。本研究连续5 d 对对照组C、实验组B、实验组P对虾肠道微生物和B 组养殖塘中挂设的生态基（S）附着微生物进行测序，分析其微生物群落结构及多样性特征，探讨肠道微生物群落结构对对虾生长的影响。
2.3.1 微生物群落多样性及稳定性
应用Illumina MiSeq 平台对连续5 d 实验获取的各组对虾肠道和生态基微生物样品进行测序，并对获得的原始序列进行质控，共获得1 494 508 条有效序列。根据测序结果对对虾肠道微生物Alpha 多样性指数Coverage、Chao1、Shannon、Simpson 进行计算。结果表明各处理组对虾肠道Coverage 指数均接近于1.00（表4），说明各样品测序覆盖率高，测序数据量合理。各样品的稀释曲线均趋向饱和（图1-a），进一步说明了数据的合理性。
图1 不同处理组凡纳滨对虾肠道微生物多样性分析（a.稀释曲线；
b.PCA 分析图）Fig.1 Analysis of intestinal microbial diversity of L.vannamei in different treatment groups（a.rarefaction curve;b.PCA analysis）
Alpha 多样性指数反映生物环境内物种的丰富度、均匀度和多样性，已有研究表明健康幼虾多样性指数显著高于患病成虾[19]。本研究中显示各组对虾肠道微生物Alpha 多样性指数没有显著性差异（P＞0.05），可能是因为各组对虾处于相同生长阶段并且健康状况相似。所有实验组的Chao1、Shannon、Simpson 指数平均值均高于C 组，其中，P 组的Chao1 指数最高（1 559.30±53.26），而B 组的Shannon 指数（8.54±0.05）和Simpson 指数（0.995±0.000 2）都是最高的（表4），说明实验组B 的微生物种类最丰富，且种类分布也最均匀。PCA 分析可以反映样本差异性[20]。如图1-b 所示，C1、C3、P1 样本与其他样本距离相对较远，说明C、P 组样本之间离散程度较大，而B 组样本之间更加紧凑，说明B 组连续5 d 样本的差异性及变化程度小于其他组，表明B 组对虾肠道微生物群落结构的稳定性高于其他组。B 组对虾增重率、特定生长率和产量均高于其他组（表1），说明肠道微生物多样性和稳定性有利于调节微生物群落动态平衡，提高对虾的抗病能力，改善对虾生长状况。
表4 不同处理组凡纳滨对虾肠道微生物Alpha 多样性指数统计（n=5）Tab.4 Alpha diversity index of L.vannamei intestinal microbials in different treatment groups（n=5）
2.3.2 微生物群落结构
本研究分别从门和属分类水平上统计对虾肠道和生态基附着微生物群落结构组成与相对丰度（图2）。首先，在门水平上，对虾肠道微生物与生态基附着微生物组成相似，依次为拟杆菌门Bacteroidota、变形菌门Proteobacteria、厚壁菌门Firmicutes 和放线菌门Actinobacteriota（图2-a），说明对虾存在固有肠道微生物群落结构[21]，但是各组样品优势菌相对丰度有差异，其中，生态基表面拟杆菌门（45.61%±3.35%）、变形菌门（45.7%±2.21%）最高，实验组P 对虾肠道厚壁菌门（25.7%±4.49%）、放线菌门（5.41%±2.36%）最高，这可能和养殖环境与宿主的差异性有关，该结果与XUE Ming,et al[22]报道的健康的对虾肠道微生物群落结构组成及特点相同。在属水平上，对虾肠道优势菌属和生态基表面优势菌属没有重叠。对虾肠道优势菌属相对丰度从高到低依次为鼠杆状菌属Muribaculaceae、拟杆菌属Bacteroidia、普雷沃式菌属Prevotella 和埃希氏-志贺氏菌属Escherichia-Shigella（图2-c）。生态基上的优势菌属相对丰度从高到低依次为栖河菌属Fluviicola、交替单胞菌属Alteromonas、弧菌属Vibrio、海洋杆形菌属Thalassotalea（图2-d）。孙振丽等[23]发现养殖水环境与对虾肠道微生物群落有显著差异，本研究结果表明生长环境对微生物的定殖具有选择性。
图2-a 显示，B 组对虾肠道拟杆菌门相对丰度（36.53%±1.25%）高于其他组，同时生态基表面拟杆菌门（45.61%±3.35%）显著高于对虾肠道（P＜0.05）（图2-a）。图2-c 显示，各组对虾肠道优势菌属没有显著性差异，可能是因为对虾生长阶段和健康状况相似。B 组对虾肠道前3 位的优势菌属均隶属于拟杆菌门，相对丰度均高于其他组（P＞0.05）（图2-c），同时生态基表面隶属于拟杆菌门的栖河菌属相对丰度（26.05%±4.79%）显著高于其他菌属（P＜0.05）（图2-d）。上述结果说明B 组在相对于C 组减半投放EM 菌和微藻膏的情况下，受生态基拟杆菌相对丰度的较高影响，B 组对虾肠道拟杆菌相对丰度提高。生态基上附着的大量微生物形成了对虾的天然饵料，其表面附着的微生物结构能够直接影响对虾肠道的微生物群落结构，与裴鹏兵等[24]发现生态基能提高对虾肠道微生物群落结构丰富度和复杂性的结果相一致。
图2 凡纳滨对虾肠道和生态基附着微生物门（a,b）、属（c,d）水平群落结构组成（n=5）Fig.2 Composition of microbial community in L.vannamei intestine and ecobase at the levels of phylum（a,b）,genus（c,d）（n=5）
肠道微生物与对虾消化吸收、营养代谢、免疫防御等生理活动密切相关，核心微生物是影响对虾肠道微生物群落结构和功能的主导者[25]。有报道称，拟杆菌是与机体营养代谢相关的重要菌群[26]，其中鼠杆状菌属[27]、拟杆菌属[28]、普雷沃式菌属[29]有助于宿主分解含氮物质，调节血糖血脂，维持肠道稳态。同时，拟杆菌可以通过直接合成氨基酸，分泌消化酶等方式促进对虾氨基酸的合成，提高对虾肌肉中氨基酸的含量。本研究结果显示实验组B 中的拟杆菌门属的相对丰度高于其他组，说明B 组对虾代谢能力和肠道内稳态优于其他组。实验组B 的对虾增重率、特定生长率、产量和肌肉中氨基酸品质高于其他组（表1、2），也印证了拟杆菌在对虾生长中的作用。实验组B 中，对虾肠道微生物的多样性、均匀度和稳定性也是最优的（表4，图1），说明拟杆菌能够调节肠道内环境平衡，提高对虾肠道结构稳定性，维持对虾正常的生命活动，促进对虾优良生长。
图2-a 显示，各实验组对虾肠道内厚壁菌门、放线菌门相对丰度均高于生态基上的该两类细菌，尤其是P 组，显著高于生态基上附着菌群的丰度（P＜0.05），表明厚壁菌门、放线菌门在对虾肠道中具有更强的定殖能力，这与肠道中具有更丰富的营养物质有关。实验组对虾肠道厚壁菌门、放线菌门相对丰度均高于C组，其中P 组最高，分别占细菌总数的25.7%±4.49%和5.41%±2.36%（图2-a）。GUO Haipeng,et al[3]发现饲料中C/N 比的增加与厚壁菌门、放线菌门的富集呈正相关，本研究也表明“格义净”为对虾提供碳源从而促进对虾肠道中厚壁菌门、放线菌门的定殖。已有研究发现，厚壁菌门在宿主生长过程中参与蛋白质、脂肪等复杂大分子有机物质的转化，为有机体提供营养和能量[30]。放线菌门可以降解淀粉和蛋白质等化合物，产生多种抗生素、维生素酶，并抑制致病菌的活性[31]。本研究中所有实验组的对虾增重率及产量均高于C组，且饵料系数均低于C 组（表1），说明定殖在对虾肠道的厚壁菌门和放线菌门有助于提高机体代谢潜力，促进对虾饲料的消化与利用，降低饵料系数并提高对虾产量[32]。
厚壁菌门和拟杆菌门在营养物质代谢与吸收方面存在着相互促进的共生关系。BROWN,et al[30]发现患有肥胖小鼠肠道厚壁菌门与拟杆菌门比值（F:B）更高。图2-b 显示，各组对虾的比值显著高于S（P＜0.05），其中P 组（0.81±0.21）最高，同时P 组对虾肌肉中n-6PUFA（24.83%）高于其他组（P＞0.05）（表3）。谢梦琪等[33]发现成虾比值（0.55）高于幼虾比值（0.47），显示出成虾更强的分解食物和吸收能量的能力，本研究结果也表明高F:B 会加强宿主肠道脂肪代谢和能量吸收，提高对虾肌肉脂肪酸含量。
变形菌门是海水养殖环境和对虾肠道中的细菌群体之一，包含大肠杆菌、沙门氏菌、弧菌和幽门螺杆菌等许多致病菌，是肠道微生物群落失调的标志性菌群。杨坤杰等[34]发现变形菌门比例越高，对虾生长面临的疾病风险越高。本实验的研究结果发现（图2-a），实验组对虾肠道变形菌门平均丰度均低于C 组（P＞0.05），说明致病菌对实验组对虾生长的危害相较对照组低。实验组对虾增重率以及特定生长率等均优于C组（表4），说明实验组对虾生长状况优于对照组，表明降低变形菌门相对丰度有助于降低对虾患病风险，改善对虾生长状况。
对虾肠道微生物结构组成及稳定性是影响宿主代谢能力和健康水平的重要因素。本研究表明优化凡纳滨对虾肠道微生物结构组成和稳定性，提高拟杆菌门、厚壁菌门、放线菌门的相对丰度和厚壁菌门/拟杆菌门比值，不仅能够促进宿主对氨基酸、脂肪酸等营养物质的消化与吸收，还能够抑制变形菌门等致病菌的繁殖，保护机体免受病原菌感染，促进对虾生长和提高肌肉品质。
本研究采用Illumina 高通量测序技术，比较不同处理系统下凡纳滨对虾肠道微生物群落结构对对虾生长、肌肉品质的具体影响，结论如下：
（1）实验组对虾增重率和特定生长率均高于C 组，B 组的对虾增重率、特定生长率以及总产量最高，分别比C 组提高11.22%、2.8%和2.45%。实验组对虾肌肉品质均高于C 组，其中，B 组的对虾肌肉氨基酸含量最高，P 组脂肪酸含量高于其他组。
（2）对虾肠道具有固定的微生物群落结构，主要优势菌群包括拟杆菌门、变形菌门、厚壁菌门、放线菌门。肠道微生物的定殖易受环境影响，生态基的微孔结构有助于促进拟杆菌门、厚壁菌门等有益菌的繁殖，从而影响到凡纳滨对虾肠道微生物结构，以及厚壁菌门与拟杆菌门的比值（F:B）。
（3）改善凡纳滨对虾肠道微生物结构组成和稳定性，提高拟杆菌门、厚壁菌门等有益菌相对丰度和F:B 值，降低变形菌门相对丰度对促进对虾消化吸收和营养代谢，降低对虾患病风险，促进对虾生长和提高肌肉品质有重要意义。
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