刘汉屈，张燕芳，张帆，孔娜，王建刚
胃癌是临床常见消化道恶性肿瘤，至2019年我国胃癌发病率已达43.1/10万左右[1]。化疗可有效延长晚期胃癌患者生存期，但整体预后依然不理想，化疗耐药是化疗失败的主要原因[2]。微小RNA(miRNA，miR)在肿瘤增殖、侵袭、耐药等多种生物学过程起着重要调控作用[3]。miR-124-3p、miR-361-5p在肺腺癌、胃癌病情进展中的作用已有报道，但研究多集中于体外研究或动物学研究[4-5]，而在临床中的研究较少，且关于二者在胃癌患者外周血循环中的表达与临床病理参数的关系尚不清楚。磷脂酰肌醇3激酶/丝苏氨酸蛋白激酶/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(PI3K/AKT/mTOR)是细胞自噬及耐药的关键通路[6-7]。本研究旨在探讨血清miR-124-3p、miR-361-5p与晚期胃癌患者临床病理特征、化疗敏感性及PI3K/AKT/mTOR通路的关系，为晚期胃癌的治疗提供参考，报道如下。
1.1 临床资料 选取2020年3月—2022年2月云南省第三人民医院消化内科收治的晚期胃癌患者90例为研究组，男48例，女42例，年龄48～73(61.30±7.61)岁；
合并症：高血压13例，高脂血症7例，糖尿病10例；
不良习惯：吸烟史18例，饮酒史13例，喜腌制食品67例，喜辛辣食品47例，不进早餐40例；
家族史：胃癌家族史14例，慢性萎缩性胃炎家族史15例；
体力状况ECOG评分0～1分58例，2分32例；
TNM分期：ⅢB期28例，Ⅳ期62例。另选取同期医院健康体检者45例为健康对照组，男24例，女21例，年龄50～72(60.71±6.85)岁；
不良习惯：吸烟史8例，饮酒史6例，喜腌制食品20例，喜辛辣食品15例，不进早餐13例；
家族史：胃癌家族史1例，慢性萎缩性胃炎家族史2例。2组患者性别、年龄、吸烟史、饮酒史、不进早餐习惯占比比较，差异无统计学意义(P>0.05)；
研究组患者喜腌制食品、喜辛辣食品、胃癌家族史、慢性萎缩性胃炎家族史占比高于健康对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。本研究通过医院医学伦理委员会批准[(2019)医伦审第12号]，受试者及家属均知情同意并签署知情同意书。
1.2 病例选择标准 (1)纳入标准：①年龄18～85岁；
②符合晚期胃癌诊断标准[8]，且经病理学或细胞学明确诊断，TNM分期ⅢB～Ⅳ期；
③不符合手术切除指征者，或既往手术治疗术后化疗结束1年以上复发或单一远处转移者；
④既往未接受含紫杉醇方案化疗者；
⑤卡氏评分>60分，ECOG评分≤2分；
⑥有影像学测量病灶。(2)排除标准：①合并其他部位原发性恶性肿瘤者；
②已出现腹膜、皮肤等广泛性转移者；
③预计生存期不足3个月；
④合并机体重要器官功能障碍者；
⑤完全性肠梗阻者；
⑥精神病史或交流障碍无法配合资料收集者。
1.3 治疗方法 研究组患者入组完善各项检查和采血后，接受紫杉醇+铂类/5-氟尿嘧啶方案化疗，具体方案：多西紫杉醇(哈尔滨三联药业股份有限公司)第1天给予75 mg/m2静脉滴注，或紫杉醇(江苏恒瑞医药股份有限公司)第1天给予135 mg/m2静脉滴注；
联合注射用顺铂(齐鲁制药有限公司)20～25 mg/m2静脉滴注，第1～3天，或氟尿嘧啶注射液(广东岭南制药有限公司)600 mg/m2静脉滴注，第1～5天。21 d为1个化疗周期。所有患者化疗至不能耐受药物不良反应或疾病进展。
1.4 观测指标与方法
1.4.1 血清miR-124-3p、miR-361-5p及外周血PI3K/AKT/mTOR信号通路mRNA表达检测：治疗前用含EDTA真空抗凝管和不含EDTA的真空管采集研究组和健康对照组受试者的空腹肘静脉血4 ml 2份，不含抗凝剂的血样离心后获得血清样本，-80℃保存待测，用于检测miR-124-3p、miR-361-5p mRNA表达水平；
含抗凝剂的血样混匀后-80℃保存全血，用于检测PI3K、AKT、mTOR mRNA表达水平。采用DNA抽提试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)获得血清及全血中的基因组DNA，Trizol法提取总RNA，离心取上清液进行纯度测定，采用逆转录试剂盒[宝生物工程(大连)有限公司]将mRNA逆转录合成互补链cDNA，并以之为模板链进行实时荧光定量PCR(RT-qPCR)，按照试剂盒设定反应体系，反应条件为：95 ℃预变性45 s、95 ℃ 10 s、60 ℃ 20 s、72 ℃ 60 s，共进行40个循环，72 ℃延伸8 min。以U6为内参基因，2-△△CT计算miR-124-3p、miR-361-5p的相对表达量，以β-actin为内参基因，2-△△CT计算PI3K、AKT、mTOR的相对表达量。引物序列见表1。
表1 血清miR-124-3p、miR-361-5p及外周血PI3K/AKT/mTOR信号通路mRNA引物序列
1.4.2 化疗敏感性评价：化疗2个周期后采用《实体瘤的疗效评价标准1.1(RECIST 1.1)》评估近期疗效。所有目标病灶完全消失为完全缓解(CR)，所有可测量目标病灶长径总和缩小≥30%为部分缓解(PR)，所有可测量目标病灶长径总和增加≥20%为疾病进展(PD)，所有可测量目标病灶长径总和变化在PR和PD之间为疾病稳定(SD)；
CR与PR患者记为化疗敏感亚组，SD与PD患者记为化疗抵抗亚组。
2.1 2组血清miR-124-3p、miR-361-5p表达水平比较 研究组血清miR-124-3p、miR-361-5p相对表达量低于健康对照组，差异均有统计学意义(P<0.01)，见表2。
表2 健康对照组与研究组血清miR-124-3p、miR-361-5p表达水平比较
2.2 不同化疗敏感程度亚组患者血清miR-124-3p、miR-361-5p表达水平比较 90例晚期胃癌患者均完成2个周期以上化疗，其中CR 2例，PR 32例，SD 38例，PD 18例，化疗敏感34例(37.78%)，化疗抵抗56例(62.22%)。化疗敏感亚组血清miR-124-3p、miR-361-5p相对表达量高于化疗抵抗亚组，差异均有统计学意义(P<0.01)，见表3。
表3 化疗敏感亚组和化疗抵抗亚组血清miR-124-3p、miR-361-5p表达水平比较
2.3 不同化疗敏感程度亚组患者外周血PI3K/AKT/mTOR信号通路mRNA表达比较 化疗敏感亚组PI3K、AKT、mTOR mRNA相对表达量低于化疗抵抗亚组，差异有统计学意义(P<0.01)，见表4。
表4 化疗敏感亚组和化疗抵抗亚组外周血PI3K、AKT、mTOR mRNA相对表达量水平比较
2.4 血清miR-124-3p、miR-361-5p在晚期胃癌患者不同临床/病理特征中比较 不同性别、年龄、ECOG评分、病理类型、肿瘤位置的患者血清miR-124-3p、miR-361-5p水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)；
低分化患者血清miR-124-3p、miR-361-5p水平低于中分化和高分化患者，且中分化患者血清miR-124-3p水平低于高分化患者(P<0.05)，而中分化与高分化患者血清miR-361-5p水平比较差异无统计学意义(P>0.05)；
TNM分期Ⅳ期患者血清miR-124-3p、miR-361-5p水平低于ⅢB期患者(P<0.01)，见表5。
表5 血清miR-124-3p、miR-361-5p在晚期胃癌患者不同临床病理特征中比较
2.5 血清miR-124-3p、miR-361-5p与PI3K/AKT/mTOR信号通路相关性分析 研究组化疗前血清miR-124-3p、miR-361-5p与PI3K、AKT、mTOR mRNA相对表达量均呈负相关(P<0.05)，见表6。
表6 晚期胃癌患者血清miR-124-3p、miR-361-5p与PI3K/AKT/mTOR信号通路相关性分析
多数胃癌患者在确诊时已是中晚期，失去最佳手术时机[9-10]。含紫杉醇化疗方案是晚期胃癌或胃癌术后复发/转移患者的主要治疗手段，临床疗效显著，且不良反应相对较少[11-12]。紫杉醇属于天然抗癌药，其抗肿瘤机制通过与微管蛋白或微管蛋白二聚体作用，诱导癌细胞有丝分裂周期停滞，从而阻止癌细胞无限增殖过程，但胃癌对紫杉醇耐药频发是晚期胃癌治疗失败的重要因素，寻找胃癌细胞药物敏感的分子生物学靶标有重要临床意义[13-14]。微小RNA一直是恶性肿瘤发生机制研究的热点。越来越多研究显示[15-17]，非编码区单链小分子RNA通过与编码区靶基因的3’-UTR区域在转录水平上特异性结合调控靶基因的表达，从而参与有丝分裂、凋亡、耐药等过程。miRNA的异常表达可导致靶基因功能异常，从而导致癌细胞对化疗药物的吸收、代谢等过程造成影响，进而影响化疗药物敏感性[18]。
miR-124-3p定位于5q31.1，在多种恶性肿瘤的发生和其他相关疾病中具有潜在作用[19-20]。刘利平等[21]研究显示，卵巢癌患者血清miR-124-3p异常低表达，且与肿瘤分级、分期及淋巴结转移有关，是卵巢癌预后预测的潜在指标。miR-361-5p属于miR-361家族成员之一，定位于X染色体q21.2外显子，已有研究显示其在卵巢癌、乳腺癌组织中低表达[22-23]，参与多种恶性肿瘤的发生及发展。本研究结果也可以看出，晚期胃癌患者血清miR-124-3p、miR-361-5p表达可能参与胃癌恶性进展，其表达水平与分化程度、TNM分期等病理特征有关。本研究中化疗敏感者血清miR-124-3p、miR-361-5p表达水平更高，说明二者表达水平与晚期胃癌化疗敏感性有关。细胞学研究显示[24]，miR-124-3p在胃癌细胞中表达上调后可通过调节E-box同源框1(ZEB1)表达，促进癌细胞对紫杉醇的敏感性。Hu等[25]研究发现，miR-124-3p在乳腺癌组织及细胞系中表达显著降低，且其表达水平与肿瘤大小、淋巴结转移显著相关，细胞水平上过表达miR-124-3p后可显著增强乳腺癌细胞对阿霉素的敏感性。Cai等[26]研究提示，miR-124-3p在细胞水平可以克服肺腺癌细胞对培美曲塞的耐药性。上述研究提示，miR-124-3p与恶性肿瘤对化疗药物的敏感性有关。Zheng等[27]研究显示，miR-361-5p/Toll样受体4信号通路可影响三阴乳腺癌细胞对紫杉醇的敏感性。临床研究显示[28]，雄激素可调控miR-361-5p表达参与去势抵抗性前列腺癌对雄激素靶向治疗的耐药过程。以上研究提示，miR-361-5p表达可能是癌细胞化疗敏感性的重要调控基因。
自噬是真核细胞的一种自我保护机制，同时具有双重调控作用，PI3K/AKT/mTOR通路是细胞内调控自噬水平的关键通路，已成为肿瘤化疗耐药机制研究的热点[29-30]。Gu等[31]研究表明，PI3K/AKT/mTOR通路可通过调控胃癌细胞自噬水平，提高胃癌细胞对顺铂化疗的敏感性。新近研究显示[32]，PI3K/AKT/mTOR信号通路中较高水平的突变基因数量可作为胃腺癌免疫治疗效果的预测因子，提示使用该通路抑制剂有助于提高胃腺癌治疗效果。上述研究说明，PI3K/AKT/mTOR参与调控自噬过程可能是影响胃癌细胞紫杉醇化疗敏感性降低的决定因素。本研究发现，胃癌患者血清miR-124-3p、miR-361-5p与PI3K、AKT、mTOR mRNA相对表达量呈负相关，提示血清miR-124-3p、miR-361-5p可能通过负调控PI3K/AKT/mTOR信号通路而参与胃癌对含紫杉醇方案化疗敏感性的调控。研究证实，miR-124-3p可通过与编码区基因相互作用抑制PI3K/AKT/mTOR的激活，从而发挥抗鼻咽癌作用[33]；
Jin等[34]发现miR-361-5p在有顺铂抗性的胃癌细胞系MGC803/DDP中的表达较MGC803细胞系显著下调，提示miR-361-5p可能参与胃癌细胞顺铂耐药的调控。由此可推测在胃癌中的调控机制可能为：miR-124-3p、miR-361-5p通过与PI3K/AKT/mTOR信号通路的靶基因的3’-UTR片段特异性结合从而抑制该信号通路的激活，通过抑制自噬来抑制胃癌的化疗抗性，而发生化疗抵抗的患者血清miR-124-3p、miR-361-5p处于低表达状态，对自噬通路抑制效果不足从而导致化疗耐药发生[35]。
综上所述，血清miR-124-3p、miR-361-5p与晚期胃癌分化程度、TNM分期及化疗敏感性有关，而且二者的低表达水平可能通过负调控PI3K/AKT/mTOR信号通路而降低胃癌对紫杉醇化疗的敏感性，为临床晚期胃癌患者选择合理化疗方案提供参考依据。但miR-124-3p、miR-361-5p在胃癌中的分子生物学机制仍需要进行深入探讨，在进一步研究中会针对治疗前后血清miR-124-3p、miR-361-5p水平的变化与化疗敏感性及PI3K/AKT/mTOR信号通路的相关性进行深入分析，为临床研究提供更多理论支持。
利益冲突：所有作者声明无利益冲突
作者贡献声明
刘汉屈：设计研究方案，实施研究过程，论文撰写，资料搜集整理，论文修改；
张燕芳：提出研究思路，论文审核；
张帆、孔娜、王建刚：分析试验数据，进行统计学分析