甘燕玲，吴伊雪， 庞树旺，陈丽丹
(1.郑州市第一人民医院检验科，河南 郑州 450000；
2.南部战区总医院检验科，广东 广州 510010；
3.郑州颐和医院超声科，河南 郑州 450000)
金属离子型无机抗菌生物材料被广泛应用于临床治疗，综合考虑其安全性、实用性和抗菌效果等因素，目前应用的抗菌金属离子主要有银离子(Ag+)、铜离子(Cu2+)和锌离子(Zn2+)，其均具有耐热性、持久性、连续性和安全性等优点。金属离子型无机抗菌生物材料可以通过调整无机生物材料的结构和性能来调控金属离子的释放速度，使其具有缓释、控释的功能，能够在较长的时间内保持有效的灭菌浓度，从而达到提高抗菌生物材料使用寿命的目的，这也是金属离子型无机抗菌生物材料成为研究热点的原因。但目前金属离子抗菌作用的相关研究多在细菌中进行，关于真菌的研究大多只针对白色念珠菌展开。研究显示，Ag+对白色念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌和光滑念珠菌5种真菌均有较强的杀灭作用，将金属银加工成纳米银后，原子排列表现为介于固态和分子之间的介态，其比表面积大，显示出明显的表面效应、小尺寸效应和宏观隧道效应，这种活性极强的纳米银微粒具有超强的抗菌能力；
Ag+可以吸附于细胞壁表面，破坏其部分生理功能，当Ag+聚集到一定量时，可穿透细胞壁进入细胞膜，抑制细胞质膜内酶活性，且可以破坏微生物DNA的分子结构，使细菌无法繁殖，从而导致死亡[1]。Cu2+、Zn2+作为生物体中必需的微量元素也在地球上大量存在，与Ag+一样具有良好抗菌性和生物相容性[2]。在过去的几十年里，Ag+、Cu2+和Zn2+由于具有较强的广谱抗菌活性和较低的耐药性而广受关注。但目前关于Ag+、Cu2+、Zn2+是否能有效杀灭或抑制真菌仍缺乏确切的证据。为了解Ag+、Cu2+和Zn2+对临床常见念珠菌的抗菌作用，本研究采用平板菌落计数法观察Ag+、Cu2+和Zn2+对白色念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌和光滑念珠菌的抗菌效果，筛选出有效杀菌浓度，旨在为抗真菌材料的设计提供理论和实验基础。
1.1 菌株白色念珠菌标准菌株ATCC-60193购自美国Microbiologics公司，近平滑念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌均为南部战区总医院检验科微生物室临床标本分离株。5种菌株均经过法国梅里埃质谱仪Vitek MS全自动快速微生物质谱系统鉴定。
1.2 主要试剂硝酸银、氯化铜、氯化锌3种试剂均购自美国默克公司。
1.3 实验方法
1.3.1 金属离子溶液的配制利用去离子水分别将硝酸银、氯化铜和氯化锌配制为0.1 mol·L-1的水溶液，经0.22 μm的细菌过滤器过滤后置于无菌容器中备用，其中硝酸银溶液的配制避光操作，将盛放硝酸银溶液的无菌容器用锡纸包裹避光存放。
1.3.2 念珠菌悬液的配备参照文献[3]的方法，取保存的白色念珠菌标准菌株ATCC-60193、近平滑念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌，加入溶菌肉汤培养液，使用比浊仪调配菌液浊度为0.5麦氏单位，然后使用无菌去离子水将菌液稀释至106CFU·L-1备用。
1.3.3 Ag+、Cu2+、Zn2+抗念珠菌效果检测取配制好的0.1 mol·L-1的硝酸银、氯化铜和氯化锌溶液，分别倍比稀释为6个浓度(10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7mol·L-1)；
分别取各浓度的金属离子溶液100 μL与配制好的5种念珠菌悬液100 μL 进行11(体积比)混合，置于96孔板中，设置6个样本组；
37 ℃培养48 h，吹吸混匀共培养液，用无菌去离子水依次稀释100、1 000倍，随后各吸取100 μL均匀涂抹于沙保弱真菌培养基，37 ℃培养48 h。同时设置0 mol·L-1的空白组，即取 100 μL 灭菌去离子水置于 96 空白孔板中，加入念珠菌悬液100 μL混合，培养48 h后稀释100、1 000倍，随后各吸取100 μL均匀涂抹于沙保弱真菌培养基，37 ℃培养48 h。每种金属离子溶液的各个梯度浓度设置3次平行重复试验，记录平板菌落数，取均值，计算杀菌率。杀菌率=(空白组菌落数-金属离子组菌落数)/空白组菌落数×100%。按照抗菌性能试验方法和抗菌效果标准QB/T2591规定，杀菌率≥99%为有强抗菌作用，杀菌率≥90%为有抗菌作用[4]。
2.1 不同浓度Ag+对5种念珠菌的抗菌效果结果见表1。Ag+浓度≥10-5mol·L-1时，作用于白色念珠菌标准菌株ATCC-60193、近平滑念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌后均无菌落生长，5种念珠菌的杀菌率均为(100.00±0.00)%。Ag+浓度为10-6mol·L-1时，克柔念珠菌、光滑念珠菌无菌落生长，杀菌率为(100.00±0.00)%。Ag+浓度为10-7mol·L-1时，作用于白色念珠菌标准菌株ATCC-60193、近平滑念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌后均有不同程度的菌落生长，杀菌率均<90%。
表1 不同浓度Ag+对5种念珠菌的抗菌效果
2.2 不同浓度Cu2+对5种念珠菌的抗菌效果结果见表2。Cu2+浓度≥10-4mol·L-1时，作用于白色念珠菌标准菌株ATCC-60193、近平滑念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌后均无菌落生长，5种念珠菌的杀菌率均为(100.00±0.00)%。Cu2+浓度为10-5mol·L-1时，热带念珠菌、近平滑念珠菌、光滑念珠菌无菌落生长，杀菌率均为(100.00±0.00)%。Cu2+浓度为10-6mol·L-1时，仅近平滑念珠菌的杀菌率>90%。Cu2+浓度为10-7mol·L-1时，作用于白色念珠菌标准菌株ATCC-60193、近平滑念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌后均有不同程度的菌落生长，杀菌率均<90%。
表2 不同浓度Cu2+对5种念珠菌的抗菌效果
2.3 不同浓度Zn2+对5种念珠菌的抗菌效果结果见表3。Zn2+浓度≥10-3mol·L-1时，作用于白色念珠菌标准菌株ATCC-60193、近平滑念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌后均无菌落生长，5种念珠菌杀菌率均为(100.00±0.00)%。Zn2+浓度为10-4mol·L-1时，白色念珠菌标准菌株ATCC-60193、热带念珠菌、近平滑念珠菌和克柔念珠菌无菌落生长，杀菌率均为(100.00±0.00)%，且光滑念珠菌杀菌率为(99.25±0.74)%。Zn2+浓度≤10-5mol·L-1时，作用于白色念珠菌标准菌株ATCC-60193、近平滑念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌后均有不同程度的菌落生长，杀菌率均<90%。
表3 不同浓度Zn2+对5种念珠菌的抗菌效果
利用金属离子杀灭有害微生物的历史十分悠久，1882年法国人Millardet成功研发出含有Cu2+杀菌作用的波尔多液，解决了困扰波尔多城多年的葡萄“霉叶病”；
自20世纪90年代起，一大批新型的抗菌材料相继问世[5]。研究发现，与传统抗菌剂相比，金属离子型抗菌生物材料因具有稳定性好、无毒性作用、抗菌活性强、广谱抗菌、不产生耐药性的优点，是近年来抗菌材料研究的热点[6]。
因为细菌和真菌的细胞结构有很大差异，所以金属离子针对细菌和真菌的抗菌机制也有所不同；
金属离子对细菌的抗菌机制有2种:(1)金属离子带正电，到达细菌细胞膜时，因细胞膜带有负电荷，金属离子能依靠库伦引力牢固吸附细胞膜，并进一步穿透细胞壁，导致细胞壁的破裂，引起细胞质的外流，阻碍细菌的繁殖，最终导致细菌的死亡；
(2)金属离子能作为催化活性中心激发水或者空气中的氧产生羟基自由基(-OH)及活性氧离子(O2-)，从而产生氧化应激反应，破坏细菌的繁殖能力，致使细菌死亡；
而金属离子对抗真菌的机制是破坏细胞的通透性，使细胞内的成分逸出，影响细胞的正常代谢，导致大多数的酶失活从而起到抗菌作用[7-8]。
念珠菌是真菌中最常见的条件致病菌，可引起皮肤黏膜浅层或全身系统性感染，是引起侵袭性真菌病最常见的病原菌。有文献报道，人工关节置换术后真菌感染虽少见，但诊治复杂困难，一旦发生，后果极其严重，是真正的灾难性并发症，引发感染的念珠菌以白色念珠菌最为多见，其次是近平滑念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌；
而白念珠菌可较其他种类真菌产生更大、更复杂的生物膜，阻挡抗真菌药物的渗入，造成耐药[9]。有学者发现，念珠菌常易定植于老年人上呼吸道，在气管插管表面形成生物被膜，引起严重的反复感染[10]。但目前很多抗菌材料的抗菌实验仅采用金黄色葡萄球菌和大肠杆菌为检测试验微生物，对真菌的抗菌性能研究很少。因此，本研究采用不同浓度的Ag+、Cu2+、Zn2+来干预白色念珠菌标准菌株ATCC-60193、近平滑念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌的生长，观察Ag+、Cu2+、Zn2+对白色念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌和光滑念珠菌的抗菌效果，并筛选出有效杀菌浓度，以期为金属离子型抗真菌材料的研究提供参考。
本研究结果显示，当Ag+浓度≥10-5mol·L-1时，对白色念珠菌标准菌株ATCC-60193、近平滑念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌5种念珠菌的杀菌率均达到了100%，具有强抗菌作用，这一结果与LI等[11]和SEFERJI等[12]的研究结果相符；
即使在较低的10-6mol·L-1浓度时，Ag+对克柔念珠菌和光滑念珠菌的杀菌率也达到100%，仍有强抗菌作用；
当Ag+浓度为10-7mol·L-1时，对这5种念珠菌仍有一定的杀菌率，但杀菌率均<90%，此时无抗菌作用。而Cu2+浓度≥10-4mol·L-1时，对白色念珠菌标准菌株ATCC-60193、近平滑念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌5种念珠菌的杀菌率达到了100%，具有强抗菌作用；
但Cu2+浓度为10-5mol·L-1时仅对热带念珠菌、近平滑念珠菌、光滑念珠菌的杀菌率达到100%，具有强抗菌作用；
当Cu2+浓度为10-6mol·L-1时，仅对近平滑念珠菌具有(95.57±2.07)%的杀菌率，具有抗菌作用，对其他4种念珠菌的杀菌率均小于90%；
当Cu2+浓度为10-7mol·L-1时，对这5种念珠菌的杀菌率均<90%，不具有抗菌作用。当Zn2+浓度≥10-3mol·L-1时，对白色念珠菌标准菌株ATCC-60193、近平滑念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌5种念珠菌的杀菌率达到了100%，具有强抗菌作用；
Zn2+浓度为10-4mol·L-1时，对白色念珠菌标准菌株ATCC-60193、热带念珠菌、近平滑念珠菌和克柔念珠菌的杀菌率达到了100%，且对光滑念珠菌的杀菌率≥99%，均具有强抗菌作用；
而当Zn2+浓度≤10-5mol·L-1时，对白色念珠菌标准菌株ATCC-60193、近平滑念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌的杀菌率均<90%，不具有抗菌作用。
以上结果提示，Ag+、Cu2+、Zn2+对不同的念珠菌均具有一定程度的抗菌作用，但随着离子浓度的降低，其杀菌率不同程度下降，其中Ag+具有更强、更广谱的抗菌性能。
另外，具体到不同的念珠菌，Ag+、Cu2+、Zn2+这3种金属离子的杀菌能力也不同。对于白色念珠菌，Ag+、Cu2+、Zn2+具有抗菌作用的最低浓度分别为10-5、10-4、10-4mol·L-1，Ag+的杀菌能力强于Cu2+和Zn2+；
对于热带念珠菌，Ag+、Cu2+、Zn2+具有抗菌作用的最低浓度分别为10-5、10-5、10-4mol·L-1，Ag+和Cu2+的杀菌能力相当，二者均强于Zn2+；
对于近平滑念珠菌，Ag+、Cu2+、Zn2+具有抗菌作用的最低浓度分别为10-5、10-6、10-4mol·L-1，三者的杀菌能力Cu2+>Ag+>Zn2+；
对于克柔念珠菌，Ag+、Cu2+、Zn2+具有抗菌作用的最低浓度分别为10-6、10-4、10-4mol·L-1，Ag+的杀菌能力强于Cu2+和Zn2+；
对于光滑念珠菌，Ag+、Cu2+、Zn2+具有抗菌作用的最低浓度分别为10-6、10-5、10-4mol·L-1，三者的杀菌能力Ag+>Cu2+>Zn2+。即对于白色念珠菌、克柔念珠菌和光滑念珠菌，Ag+的抗菌作用最强(有效抗菌浓度最低)，Cu2+的抗菌作用次之；
而对于热带念珠菌，Ag+和Cu2+的抗菌作用相当，且均强于Zn2+；
但对于近平滑念珠菌，则Cu2+的抗菌作用最强(有效抗菌浓度最低)，其次为Ag+。有研究发现，铜可抑制生物膜的形成，而近平滑念珠菌是引起导管相关性感染最主要的念珠菌，如果将铜离子应用于导管材料，可以降低由近平滑念珠菌引起的相关感染，对相应的临床治疗材料的选择有一定的指导意义[13-14]。
综上所述，Ag+、Cu2+、Zn2+对白色念珠菌标准菌株ATCC-60193、近平滑念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌5种常见念珠菌的生长均具有一定的抑制作用，但杀菌率随着离子浓度的下降而下降，且同一金属离子对不同念珠菌的最佳抗菌浓度不相同；
Ag+、Cu2+、Zn2+同时对5种常见念珠菌均具有抗菌作用的最低浓度分别为10-5、10-4、10-4mol·L-1，其中Ag+具有更强、更广谱的抗菌性能。本研究为金属离子Ag+、Cu2+、Zn2+在抗真菌性能方面的应用研究以及金属离子型抗菌生物材料的设计和改进提供了参考。