刘 超，岳阳阳，张孟钊，刘 爽，李小兵，李 延
腹主动脉瘤(abdominal aortic aneurysm, AAA)是炎症、氧化应激等因素所致腹主动脉不可逆扩张，随着瘤体直径增大，破裂风险增加，瘤体一旦破裂，病死率可达80%以上[1]。目前，临床治疗AAA以手术或介入治疗为主，尚无药物治疗方法，深入了解其发病机制，寻找有效治疗靶点，可为临床治疗提供新的思路和方向[2]。中性粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞等炎性细胞浸润是AAA的主要病理机制之一，研究发现，趋化因子在腹主动脉壁炎性细胞黏附聚集过程中发挥重要作用[3]。CXC趋化因子受体2(CXCR2)是CXC趋化因子受体家族成员，在炎性细胞中广泛表达，介导疾病的炎症反应过程，故推测其可能参与AAA的发生与发展，但目前CXCR2与AAA关系的相关研究较少[4]。除此之外，基质金属蛋白酶(MMPs)所介导的胶原蛋白与弹力纤维降解也是AAA的重要病理机制之一[5]。本研究旨在分析AAA组织CXCR2表达及其与已知炎性细胞因子基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的关系，以深入了解AAA的发病机制，为临床诊治提供新的思路和方向，详述如下。
1.1研究对象 选择2019年7月—2022年7月我院80例AAA作为观察组。①纳入标准：经影像学检查及手术病理证实为AAA；
患者知情同意并自愿配合。②排除标准：存在自身免疫性疾病、感染性疾病者；
近期应用免疫抑制剂、糖皮质激素类药物者；
临床资料不完整者。另选取同时期行腹动脉-股动脉移植术者40例作为对照组。观察组男44例，女36例；
年龄31～68(56.27±8.45)岁。对照组男24例，女16例；
年龄29～66(55.76±6.80)岁。2组性别、年龄比较差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。
1.2方法
1.2.1样本采集：留取观察组术中AAA前壁组织及对照组腹前动脉血管吻合处正常动脉壁组织，甲醛固定、脱水、石蜡包埋、切片，-80 ℃冻存待检。
1.2.2免疫组织化学检测[6]：二甲苯、梯度酒精脱蜡脱水，PBS缓冲液冲洗，加3%过氧化氢甲醇液、3%山羊血清封闭液，依次加CXCR2单克隆抗体、MMP-9单克隆抗体，4 ℃过夜。PBS缓冲液冲洗，加二抗，37 ℃孵育50 min。二氨基联苯胺显色，苏木精复染。400倍镜下，随机选择5个视野观察，统计阳性细胞的占比。阳性细胞占比评分：无阳性细胞计0分，阳性细胞占比<25%计1分，25%≤阳性细胞占比≤50%计2分，50%<阳性细胞占比<75%计3分，阳性细胞占比≥75%计4分。染色强度评分：无染色计0分，轻度染色计1分，中度染色计2分，重度染色计3分。总分=阳性细胞占比评分×染色强度评分，总分>3分为阳性，否则为阴性。
1.2.3蛋白免疫印迹法：组织样本加入蛋白提取液制成匀浆，4 ℃过夜，15 000 r/min离心50 min分离上清液，使用BCA蛋白浓度测定试剂盒(美国Thermo)，测定蛋白浓度。聚丙烯酰胺凝胶电泳，各泳道加入30 μg蛋白上清液，转移至PVDF膜，加5%脱脂牛奶，封闭放置2 h。分别加入CXCR2单克隆抗体、MMP-9单克隆抗体，4 ℃封闭放置过夜；
PBS缓冲液冲洗，加入稀释至1∶5000辣根过氧化物酶标记的马抗鼠IgG二抗(美国Sigma)，37 ℃孵育2 h。PBS缓冲液冲洗，加入ECL化学发光显影试剂(上海杰美基因医药科技)，分析目的条带光密度值。
1.2.4RT-PCR：采用TRIzol RNA提取试剂盒(美国Invitrogen公司)提取总RNA，采用紫外分光光度法测定总RNA浓度。取1 μg总RNA，RNA逆转录模板1 μl，逆转录缓冲液3 μl，逆转录酶2 μl，上游引物1 μl，下游引物1 μl，加双蒸水至20 μl总反应体系，37 ℃反应50 min，逆转录为cDNA，试剂盒购自美国Promega公司。PCR反应体系：cDNA 2.5 μl，PCR试剂混合液12.5 μl，DEPC 8 μl，上下游引物各1 μl。反应条件：95 ℃预变性1 min，95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共循环40次，72 ℃延伸5 min。引物序列：CXCR2上游：5"-CAGCGACCCAGTCAGGATTTA-3"，下游：5"-ACCAGCATCACGAGGGAGTTT-3"，扩增片段长度251 bp；
MMP-9上游：5"-GCTGGTGTTATGTGAAGTTTTCAAG-3"，下游：5"-CCGTTTACAGGTGTGCCTCAAATGG-3"，扩增片段长度317 bp；
内参引物序列上游：5"-ATCATGTTTGAGACCTTCAACA-3"，下游：5"-CATCTCTTGCTCGAAGTCCA-3"，扩增片段长度318 bp，均由北京三博远志公司提供。琼脂糖凝胶电泳分离PCR扩增片段，分析基因相对表达量。
1.3观察指标 比较2组CXCR2、MMP-9蛋白表达及mRNA表达水平。比较不同临床病理特征AAA患者CXCR2蛋白表达情况，并分析CXCR2与MMP-9蛋白表达的相关性。
2.1CXCR2、MMP-9蛋白表达阳性率比较 免疫组织化学检测结果显示，观察组CXCR2、MMP-9蛋白表达阳性率均高于对照组(P<0.01)。见表1。
表1 2组不同组织CXCR2、MMP-9蛋白表达阳性率比较[例(%)]
2.2CXCR2、MMP-9蛋白表达量比较 蛋白免疫印迹法结果显示，观察组CXCR2、MMP-9蛋白表达量均高于对照组(P<0.01)。见表2。
表2 2组不同组织CXCR2、MMP-9蛋白表达量比较
2.3CXCR2、MMP-9 mRNA相对表达量比较 RT-PCR结果显示，观察组CXCR2、MMP-9 mRNA相对表达量均高于对照组(P<0.01)。见表3。
表3 2组不同组织CXCR2、MMP-9 mRNA相对表达量比较
2.4不同临床病理特征AAA患者CXCR2蛋白表达情况比较 瘤体直径≥5 cm、有心脑血管意外史AAA患者CXCR2蛋白表达阳性率分别高于瘤体直径<5 cm、无心脑血管意外史患者(P<0.01，P<0.05)。见表4。
表4 不同临床病理特征AAA患者CXCR2蛋白表达情况比较[例(%)]
2.5CXCR2与MMP-9蛋白表达量相关性分析 Pearson相关性分析显示，CXCR2与MMP-9蛋白表达量呈正相关(r=0.547，P<0.001)。
AAA发生是一个慢性过程，其中一个重要环节是单核细胞募集至腹主动脉内壁，并进入外膜，引发炎症反应，在炎性细胞的趋化过程中，趋化因子发挥重要作用[7]。CXCR2是G蛋白耦联受体超家族成员，在单核巨噬细胞、中性粒细胞表面表达，刺激炎性细胞的趋化[8]。既往研究证实，CXCR2与动脉粥样硬化密切相关，而动脉粥样硬化又是AAA的已知危险因素之一，故推测CXCR2可能参与AAA的发生与发展[9]。本研究结果显示，AAA组织CXCR2蛋白表达阳性率高于正常动脉壁组织，AAA组织CXCR2蛋白表达量高于正常动脉壁组织，AAA组织CXCR2 mRNA相对表达量高于正常动脉壁组织，这一结果与既往研究相符[10]，证实CXCR2在AAA组织中高表达，提示其可能参与AAA的发生。
针对AAA患者临床病理特征的分析显示，瘤体直径≥5 cm和有心脑血管意外史AAA患者CXCR2蛋白表达阳性率分别高于瘤体直径<5 cm和无心脑血管意外史患者，表明CXCR2蛋白表达升高提示患者处于病情更严重、风险更高的状态。AAA的组织学改变以腹主动脉壁胶原降解、炎性细胞浸润、血管新生等为主[11]。腹主动脉细胞外基质以胶原、弹力蛋白为主要成分，二者的合成与降解在正常生理状态下可保持动态平衡，进而维持腹主动脉正常的结构功能[12]。而病理状态下，炎性细胞分泌大量MMPs，使胶原酶激活，胶原蛋白分解加速，导致腹主动脉持续扩张[13]。MMPs是以钙离子、锌离子为辅助因子的蛋白水解酶，可降解细胞外基质中的蛋白成分，在组织重构、炎症反应及心血管疾病、恶性肿瘤中起关键作用。MMP-9可促进弹力蛋白降解，降解产物可趋化白细胞，进一步导致炎性细胞浸润，促成AAA的发生与发展。有研究证实，AAA血管壁中MMP-9表达上调，参与慢性炎症反应，进而介导血管重塑[14]。本研究Pearson相关性分析发现，CXCR2与MMP-9蛋白表达量呈正相关，表明CXCR2表达上调可能通过靶向调控MMP-9过表达，进而参与AAA的发生与发展。
综上所述，CXCR2、MMP-9在AAA患者主动脉瘤组织中表达上调，且CXCR2与MMP-9蛋白表达量具有正相关性，CXCR2可能通过调节MMP-9的表达，参与炎性细胞浸润与慢性炎症反应，进而促进AAA的发生与病情进展。
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