王玲 杨馥宇 黄超
(华北理工大学附属医院 1呼吸科，河北 唐山 063000；
2眼科)
阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征(OSAHS)主要是间歇性缺氧，可导致多系统损害，尤其是神经系统，备受人们的关注〔1〕。体外动物试验显示间歇低氧可导致神经细胞的凋亡，是神经系统损伤的主要机制之一〔2〕。同时间歇低氧可引起神经细胞自噬的出现〔3〕。既往对间歇低氧早期导致神经细胞凋亡及自噬已有相关报道，但罕有应用临床药物干预来探讨早期间歇低氧损伤后自噬在神经细胞凋亡中发挥作用的研究。本实验应用临床上氧自由基清除剂依达拉奉干预，探讨依达拉奉对早期间歇低氧大鼠神经细胞自噬与凋亡的影响。
1.1主要仪器、试剂 自噬效应蛋白(beclin)-1及微管相关蛋白1轻链(LC)3-Ⅱ兔抗鼠多克隆抗体、免疫球蛋白(Ig)G羊抗兔单克隆抗体、PV6001试剂盒均购自欣博盛生物科技有限公司，TUNEL试剂盒由瑞士Roche公司提供，H-7650透射电镜由日本日立公司提供。
1.2实验动物及分组 96只雄性Wistar大鼠，采用随机表法分为对照组、5%间歇低氧(IH)组及依达拉奉(ED)组，每组又分为1 d、3 d、7 d、14 d 4个亚组，每个亚组8只大鼠。
1.3动物模型的制备 5%IH组大鼠实验箱内首先注入流速为10 L/min的氮气30 s，使试验箱内的氧浓度降至5%，半分钟后注入流速为10 L/min的空气40 s，使氧浓度至21%，再注入50 s的空气，流速改变为5 L/min，使氧浓度维持21%。按上述操作，每2 min为1个周期循环。ED组大鼠尾静脉注射依达拉奉(3 mg/kg)，30 min后置于低氧箱内，与IH组大鼠实验一致。对照组大鼠实验箱内持续注入流速为3 L/min的空气，氧浓度保持在21%。以上3组实验均每日进行8 h，持续进行1 d、3 d、7 d、14 d。
1.4透射电镜标本制备 实验结束后，对大鼠进行麻醉及灌注固定术后，于冰上取出海马组织，修剪成1 mm×1 mm×1 mm大小的组织块，分别进行预固定(2.5%戊二醛，时间为4 h)、固定(1%锇酸缓冲液，时间为2 h)。固定结束后，进行脱水、包埋、超薄切片、染色等步骤，最后于电镜下摄片。
1.5免疫组织化学法检测蛋白的表达 脑组织经脱水、透明、包埋等步骤后进行切片，供组织化学法应用。按PV法进行组织化学法操作步骤，将切好的完整切片脱蜡、脱水、高压修复后，分别滴加一抗(beclin-1兔抗大鼠抗体、LC3-Ⅱ兔抗大鼠抗体)，4℃冰箱内过夜，滴加二抗等，按二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒操作步骤进行显色后，进行脱水、透明、封片。
1.6Tunel法计算神经细胞的凋亡情况 海马组织切片进行脱蜡、脱水后经3%浓度的过氧化氢(H2O2)室温浸泡、TBS溶液漂洗、加入蛋白酶K工作液、TBS溶液漂洗、加入TUNEL工作液、TBS溶液漂洗、加入山羊血清工作液进行封闭、加入POD-转化液等，按试剂盒操作步骤进行显色、苏木素复染、脱水、透明、封片，最后进行摄片。应用Image-Pro Plus 图像分析软件进行分析，神经细胞凋亡指数(AI)=凋亡细胞数/总细胞数×100%。
1.7统计学方法 采用SPSS22.0软件进行单因素方差分析、独立样本t检验。
2.1透射电镜观察海马CA1区神经细胞的超微结构 对照组神经细胞形态正常，染色质均匀，线粒体、高尔基体等细胞器结构正常；
与对照组比较，5%IH组从间歇低氧损伤3 d开始逐渐出现神经元变形肿胀，核膜模糊，染色质密度欠均匀，线粒体空泡化、嵴出现断裂，激活溶酶体，出现自噬小体，随着低氧时间的延长，损伤越重；
与5%IH组比较，ED组各个时间点神经元超微结构损伤减轻，自噬小体数目增多。见图1。
图1 透射电镜下观察各组海马CA1区神经细胞超微结构(×15 000)
2.2免疫组织化学法检测beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白的相对表达 对照组神经细胞beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白表达较少，各个时间点差异无统计学意义(P>0.05)；
与对照组比较，5%IH组及ED组各个时间点神经细胞beclin-1、LC3-Ⅱ的表达量显著增多(P<0.05)；
与5%IH组比较，ED组各个时间点神经细胞beclin-1、LC3-Ⅱ的相对表达量显著增多(P<0.05)。见表1、图2、图3。
表1 3组不同时间点beclin-1及LC3-Ⅱ蛋白表达比较
图2 光学显微镜下观察3组不同时间点beclin-1蛋白的相对表达(免疫组织化学法，×400)
2.3TUNEL法检测海马CA1区神经细胞的凋亡情况 对照组海马CA1区神经细胞凋亡较少，各个时间点AI差异无统计学意义(P>0.05)；
与对照组比较，5%IH组及ED组各个时间点神经细胞AI显著增加(P>0.05)；
与5%IH组比较，ED组各个时间点神经细胞AI降低，差异有统计学意义(P>0.05)。见表2、图4。
表2 TUNEL法检测各组神经细胞AI的比较
图4 光学显微镜下观察各组不同时间点神经细胞凋亡的情况(TUNEL染色,×400)
OSAHS主要是指睡眠过程中反复出现上气道阻塞，引起睡眠暂停及低通气，进而导致一系列临床症状及并发症〔4〕。研究证实间歇低氧可导致神经系统损害，且机制复杂多样。其中间歇低氧导致神经细胞的凋亡是神经系统受损的重要机制之一〔5〕。细胞凋亡受多种因素的调节，是细胞的程序性死亡，凋亡与自噬密切相关，细胞凋亡受自噬活性的调节〔6〕。在脑缺血、脑创伤等神经损伤中自噬均被激活，进而发挥神经保护作用。beclin-1及 LC3-Ⅱ均是特异的自噬诊断指标，分别是酵母中作为自噬密切相关基因Atg6及Atg8在哺乳动物体内的同源物〔7〕。在对胰腺癌干细胞的研究中发现，间歇性缺氧诱导了自噬相关蛋白beclin-1、LC3-Ⅱ的表达，进而激活自噬〔8〕。本实验结果同样显示，间歇低氧早期促进了大鼠海马CA1区神经细胞的自噬相关蛋白beclin-1、LC3-II的表达，诱导了自噬的发生。
依达拉奉是临床常用的一种抗氧化剂及氧自由基清除剂，广泛应用于脑梗死等多种神经系统疾病，可改善神经系统损伤〔9〕。通过模拟OSAHS发病机制制备间歇低氧模型，发现依达拉奉通过抑制氧化应激对间歇低氧损伤后神经细胞发挥保护作用〔10〕。动物实验也证实，依达拉奉能明显减少间歇低氧损伤后神经细胞的凋亡，但依达拉奉对间歇低氧自噬的影响研究尚少，本实验结果显示：依达拉奉可提高早期间歇低氧大鼠海马神经细胞的自噬水平，进而减少神经细胞的凋亡，发挥神经保护作用。这与既往对蛛网膜下腔出血中依达拉奉对大鼠海马神经元自噬及凋亡影响研究结果一致〔11〕。
综上所述，间歇低氧早期可导致神经元自噬及凋亡的出现，应用依达拉奉治疗后，可提高大鼠海马神经细胞的自噬水平，进而减少神经细胞的凋亡，发挥神经保护作用，为临床早期治疗OSAHS提供动物实验证据。
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