刘丽欣，郭正光，孙伟，刘俊涛*
(1.中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院妇产科，国家妇产疾病临床医学研究中心，北京 100730；
2.中国医学科学院 北京协和医院 基础医学院，北京 100730)
子痫前期(Preeclampsia，PE)是一种妊娠期特发的疾病，发病率为2%～8%，可导致流产、早产、胎儿生长受限、妊娠后妇女心血管病以及新生儿和产妇死亡等[1-2]。尽管在过去几十年中进行了深入的研究，但PE的发病机制尚未完全阐明，因此缺乏特异性的检测指标和方法来进行早期诊断或预测疾病的严重程度，目前分娩是唯一有效的治疗方法。
早在PE临床特征表现之前致病因素就已产生，因此及时诊断和适当治疗，可以改善孕产妇和围产期结局。然而，临床中可靠的筛选试验尚未广泛开展，多普勒超声测量的子宫动脉搏动指数(PI)、可溶性酪氨酸激酶1(sFlt-1)、胎盘生长因子(PlGF)、可溶性内皮素(sEng)、胎盘蛋白13(PP-13)、妊娠相关血浆蛋白 a(PAPP-a)和血管内皮生长因子(VEGF)，已被提议作为PE检测的潜在生物标记物[3-5]。Zeisler等[5]指出，血清sFlt-1/PlGF比率可以在妊娠24～36周时预测未来几周内是否会出现PE。然而，由于敏感性和特异性较低，这些标记物目前均未在临床上用于早期产前筛查。因此，发现相关的生物标志物，对帮助准确预测、诊断和治疗监测PE至关重要。
质谱技术拥有较高的灵敏度和准确率，已经逐渐成为蛋白质组学主要的研究方法[6]。蛋白质组定量技术按数据采集模式可分为数据依赖采集(DDA)和数据非依赖采集(DIA)两种。DIA对所有窗口进行无偏向的数据采集，故DIA分析产生的定量结果比DDA具有更好的信噪比和重现性，可以为低丰度蛋白质提供准确的蛋白质定量信息，在临床样本的研究中拥有广泛的研究前景[7-8]。本研究希望借助蛋白质组学方法找到PE与正常妊娠之间存在的差异蛋白，分析其作用的相关信号通路，为寻找鉴别PE的生物标志物研究奠定基础，以期应用于PE的早期诊断、监测及处理，进而减少子痫、胎儿相关严重并发症的发生。
一、研究对象
选取2019年9—12月就诊北京协和医院、符合PE诊断标准的孕妇为研究对象，选取同期正常妊娠孕妇为对照组。
PE诊断标准：妊娠 20周后血压升高，收缩压≥140 mmHg 和(或)舒张压≥ 90 mmHg，伴有蛋白尿≥ 3.0 g/24 h，或随机尿蛋白(+)或虽无蛋白尿，但出现以下标准之一者：血小板减少(血小板<100×109个/L)；
肝功能受损(血清转氨酶水平为正常浓度的2倍以上)；
肾功能损害(血肌酐水平大于1.1 mg/dl或浓度升高至正常浓度的2倍以上)；
肺水肿；
新发生的中枢神经系统异常或视力障碍。排除妊娠合并免疫病、肾病、慢性高血压等合并症及并发症。本研究通过北京协和医院医学伦理委员会批准(ZS-2748)，患者签署知情同意书。
本研究共纳入PE患者(P组)5例，对照组(C组)7例。
二、仪器与试剂
Orbitrap Fusion Lumos质谱仪(Thermo Fisher，美国)、NanoEasy 1200高效液相色谱仪(Thermo Fisher，美国)、免疫亲和柱(Thermo Fisher，美国)、二硫苏糖醇(Sigma，美国)、碘乙酰胺(Sigma，美国)、胰蛋白酶(Promega，美国)、BCA试剂盒(Thermo Fisher，美国)。
三、方法
1.血液、尿液样本采集和储存：采集孕妇剖宫产分娩前24 h、分娩后24 h外周血血清及尿液，尿液需排除感染及血液污染，-20℃冰箱短暂保存，-80℃冰箱长期保存。
2.样本处理：血清样本利用免疫亲和层析柱去除高丰度蛋白；
尿液经3 000 rpm，4℃，离心10 min去除细胞碎片沉渣，二硫苏糖醇还原蛋白质，碘乙酰胺烷基化蛋白质，加入丙酮纯化后离心，沉淀用Tris溶液(三羟甲基氨基甲烷)复溶，即为尿液蛋白。血、尿蛋白质利用胰蛋白酶酶解成肽段，收集酶解液，利用BCA试剂盒测定肽段浓度。
3.质谱鉴定：取15 μl样本，与iRT肽段1 μl混合，用串联质谱仪分离，利用在线电喷雾串联质谱方法进行分析。共上样4 μl样品(分析柱：75 μm×25 cm，Acclaim PepMap C18)，以60 min的梯度分离样品，柱流量控制在250 nl/min，柱温为40℃，电喷雾电压为2 kV。流动相A相为0.1% 甲酸水溶液；
B相为含0.1% 甲酸的乙腈溶液。
肽段经由HPLC系统分离后，使用数据非依赖性采集模式进行质谱分析肽段混合物，质谱过程参数设置如下：(1)一级质谱MS：扫描范围为350～1 200 m/z，分辨率为120 000，AGC target为300，最大注入时间为50 ms；
(2)HCD-MS/MS：分辨率为30 000，AGC target为200，碰撞能量为25 eV、30 eV和35 eV，FAMIS电压为45 V；
(3)设置60个可变窗口进行采集，并同时设置重叠串口，每个窗口重叠设置为1 m/z。所有样本随机顺序上机分析。所有样本等量混合制备混合样本作为质控样本(即Mix组)。质控样本在分析前、分析后和每10个样本之间穿插上机分析，用以评估系统稳定性。
4.DIA数据分析：采用Spectronaut数据库的默认参数，根据软件自动选择理想的窗口进行提取，iRT肽段软件也可以自动矫正保留时间及质量窗口。Spectronaut自行校正后，符合条件的一级质谱离子都需要进行计算表达量，其他的干扰离子均需要去除(除非<3个碎片离子)。DIA二级分析对假阳性率<1%、排在前三的肽段进一步定量。筛选差异蛋白标准：Test分析P<0.05为差异蛋白。
5.生物信息学分析：对所有筛选出的差异蛋白进行生物通路分析(IPA)，将这些有差异表达的蛋白质的差异倍数及Swissprot编号录入IPA，并对不同组差异蛋白的结果进行比较。根据相关通路中涉及的差异蛋白数目，采用left-tailed Fisher’s精确检验法进行计算相关通路的显著性，并通过气泡图z评分和P值进行排序。
一、各组蛋白的定量分析和质量控制
血清中鉴定蛋白平均数分别为Mix组875个、P组839个、C组828个；
尿液中鉴定蛋白平均数分别为Mix组1 644个、P组682个、C组1 378个。两组测定蛋白经主成分分析及聚类分析，结果说明分析系统的稳定性、重复性良好(图1～2)。
A：血清蛋白；
B：尿液蛋白。
二、差异蛋白筛选
通过DIA方法进行血清、尿液差异蛋白鉴定，共筛选出血清中差异蛋白274个，其中P组84个，上调67个，C组190个，上调73个；
尿液中差异蛋白671个，其中P组449个，上调224个，C组222个，上调105个。红色为表达上调蛋白，蓝色为表达下调蛋白，绿色为表达无差异蛋白(图3～4)。
对差异蛋白进行组内及组间比较，具有重要功能的差异蛋白在P组和C组血清和尿液中变化趋势相对一致。P组变化趋势不一致的差异蛋白在产后血清中表达下调、尿液中表达上调，包括PRDX2、CD99、ITGB1三个蛋白；
其中CD99、ITGB1与C组变化趋势一致，即产后血清中下调，尿液中上调表达；
而PRDX2与C组表达变化不同，即C组产后血清和尿液中均上调表达。
三、生物通路分析
1.心血管与高血压相关通路：与C组相比较，P组产前、产后血液中差异蛋白在通路中变化不显著，但尿液中差异蛋白在肾素-血管紧张素信号通路、扩张型心肌病信号通路、心脏-β-肾上腺素能信号通路、心肌肥厚信号通路、肾上腺髓质素信号通路中具有显著激活作用(图5)。
A：血清蛋白；
B：尿液蛋白。
A：C组；
B：P组。红色：上调；
蓝色：下调；
绿色：无差异。
A：C组；
B：P组。红色：上调；
蓝色：下调；
绿色：无差异。
C1/C3：C组产前与产后相比；
P1/P3：P组产前与产后相比。红色表示激活，蓝色表示抑制，气泡越大，相关性越强。
2.细胞增殖与血管发生通路：与C组相比较，P组血液中VEGF水平下降；
P组尿液中与血管发生相关的Ephrin受体信号通路、TGF-β信号通路激活，Ephrin B 通路受到抑制(图6)。
3.内皮损伤相关通路：与C组相比较，P组尿液中差异蛋白在NRF2介导的氧化应激反应通路、HIF1信号通路和铁死亡信号通路中具有激活作用(图7)。
C1/C3：C组产前与产后相比；
P1/P3：P组产前与产后相比。红色表示激活，蓝色表示抑制，气泡越大，相关性越强。
4.细胞免疫相关通路：与C组相比较，P组血液中差异蛋白变化不明显，但尿液中差异蛋白在嗜酸性粒细胞通路、中性粒细胞通路、树突状细胞(DC)通路中均不同程度的激活，差异蛋白在T细胞辅助1型(Th1)和Th2通路富集(图8)。
C1/C3：C组产前与产后相比；
P1/P3：P组产前与产后相比。红色表示激活，蓝色表示抑制，气泡越大，相关性越强。
C1/C3：C组产前与产后相比；
P1/P3：P组产前与产后相比。红色表示激活，蓝色表示抑制，气泡越大，相关性越强。
与C组相比较，P组血液中差异蛋白变化不显著，但P组尿液差异蛋白可以激活白细胞介素8(IL-8)、IL-2、IL-15、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)信号通路(图9)。
与C组相比较，P组尿差异蛋白在B细胞通路激活，IL-4通路差异蛋白富集；
C组尿液中补体途径明显抑制，相比之下P组血液中差异蛋白补体增加(图10)。
C1/C3：C组产前与产后相比；
P1/P3：P组产前与产后相比。红色表示激活，蓝色表示抑制，气泡越大，相关性越强。
C1/C3：C组产前与产后相比；
P1/P3：P组产前与产后相比。红色表示激活，蓝色表示抑制，气泡越大，相关性越强。
PE是一种严重危害孕妇和婴儿健康的疾病，引起PE的原因有很多且彼此之间存在一定关联，因此单方面的原因和发病机制无法完整解释PE的发生。为了更好地了解PE的发病原因，本研究利用质谱方法，检测了PE患者血清和尿液中的差异蛋白，并通过生物信号通路分析，初步探索了与PE相关的通路变化。
差异蛋白IPA经典通路分析结果表明PE与心血管系统及高血压通路调节密切相关。胎盘缺血可产生肾素和血管紧张素类物质导致血压升高，心脏-β-肾上腺素信号增强与血压升高正相关，心肌肥厚信号及Apelin内皮细胞信号通路参与了心血管调控与免疫，这些均与PE形成相关[9]。怀孕期间血流动力学改变，包括孕中期收缩压、舒张压和平均动脉压降低，孕晚期略有升高[10]。怀孕期间心血管还会发生结构变化，这种适应性重塑导致母体心肌肥大，这种肥大是可逆的，使心脏能够应对妊娠期增加的需求，与长期心血管功能障碍无关[10]，但有研究报道PE病人血管阻力增加，左心室壁增厚[11]，可能已形成不可逆的心肌肥大，PE病人在妊娠后的心血管疾病风险也较正常孕妇高，并且这种风险可以持续超过二十年[12]。
研究显示VEGF水平下降，会影响滋养层细胞的分化和增殖，造成滋养层细胞侵入功能障碍，胎盘螺旋小动脉重塑受阻[13]。Ephrin B信号抑制，与血管发生异常相关[14]。与本研究血管发生通路显示PE组血中VEGF水平下降、PE组尿液差异蛋白显示Ephrin B信号通路抑制相符。报道称TGF-β通路普遍低甲基化，且在PE病人胎盘中表达增加[15]，与本研究PE组TGF-β信号激活相符，该通路与滋养层入侵和迁移的控制有关。TGF-β在PE患者的血清中升高，并且可抑制许多组织中的VEGF[16]，这与本研究血浆中VEGF表达水平降低相符合。
铁死亡是最近发现的一种程序性细胞死亡形式，近几年来，不断有学者指出铁死亡在胎盘功能障碍和滋养层损伤中的潜在作用，且可能与PE发生发展具有一定的相关性，铁过量及铁死亡均会使胎盘血管侵袭受阻[17]，可加重脂质过氧化，造成内皮损伤。有研究报道PE患者血清铁浓度、铁蛋白和转铁蛋白饱和度显著高于正常组，铁稳态失衡与PE相关[18]。胎盘植入过程中通常会产生活性氧(ROS)[19]，由氧化应激水平上调引起ROS和脂质过氧化的积累通常与胎盘功能受损有关[20]。本研究中，PE组尿液中NRF2介导的氧化应激反应通路被激活，引起PE内皮损伤。
Boeldt等[21]认为中性粒细胞激活后粘附至血管内皮细胞，进一步导致炎症级联反应是PE内皮损伤的主要原因。内皮损伤是心血管疾病、炎症发生发展过程的重要部分，炎症又可触发内皮细胞、淋巴细胞活化，活化的内皮细胞又会导致中性粒细胞转运增加，进一步导致级联反应[22]。活化的内皮通过IL-8促进中性粒细胞向胎盘迁移[23]，又可通过GM-CSF延长中性粒细胞的寿命[24]。PE女性子宫内膜中激活的单核细胞和巨噬细胞数量增加[25]，炎症反应过度激活，均会导致子宫小动脉重铸障碍，进一步影响胎盘着床。正常妊娠被认为是一种Th2型免疫状态，有利于免疫耐受环境。PE患者则表现为Th1/Th2失衡，是以Th1为主的母体促炎状态[26]。DC 细胞在正常妊娠期间保持失活或未成熟，然而在PE期间会受到不适当的刺激。高浓度GM-CSF与DC 中表达的长链非编码 RNA(lnc-DC)一起诱导 DC 成熟[27-28]，成熟的DC 可以更有效地呈递抗原，从而增加 Th1/Th17 细胞的增殖[28]，Th1/Th17 细胞会刺激促炎反应，从而显著降低母体耐受性。本研究显示PE患者的DC细胞通路、GM-CSF通路被激活，与之前的研究相符。
PE患者尿液中差异蛋白结果表现为B细胞通路激活、血液中差异蛋白在补体系统富集。免疫紊乱激活单核吞噬细胞系统来执行抗原提呈过程，促进淋巴细胞分化为浆细胞，然后产生过量抗体[29]。B细胞在PE中被不规则地激活，可产生血管紧张素Ⅱ-1型受体激动性自身抗体(AT1-AA)，这些抗体充当激动剂并诱导信号通路，导致血管收缩和醛固酮分泌，从而刺激肾素-血管紧张素系统并增加血压[30]。
本次研究找到差异蛋白较多，可作为后续研究的基础实验。值得注意的是PE组产后血液中降低、尿液中升高的三个蛋白，分别是PRDX2、CD99、ITGB1，考虑可能是PE终止妊娠后病情好转，因此相关蛋白在血液中快速下降，并通过尿液排出。然而CD99、ITGB1在PE组和正常组变化趋势相同，PRDX2变化趋势与正常组表达变化不同，但符合课题设想，因此需要待扩大样本量进一步行靶向验证质谱分析。
本研究是一项涉及大量循环蛋白质和相关病理生理通路的研究，这些蛋白质和通路可能为先兆子痫这一特定表型提供潜在的治疗靶点。结合IPA通路分析，PE组差异蛋白参与了炎症免疫反应过度激活、内皮损伤、血管发生异常等，激活肾素-血管紧张素、心肌肥厚等相关通路。尤其铁死亡通路显著被激活，考虑可能与PE发生发展相关。研究发现很多差异蛋白，这些蛋白有可能是PE相关病因，也有可能是PE疾病表现出的结果，这均需要我们进一步进行前瞻性研究，为后续筛选差异蛋白作为生物标记物奠定了基础。
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