陈静文， 毛日成， 张继明
慢性乙型病毒性肝炎（CHB）被定义为乙型肝炎（乙肝）病毒表面抗原（HBsAg）和/或乙肝病毒 （HBV） DNA阳性超过6个月[1]。据WHO报道[2]，至2015年全球约有2.57亿人患有CHB，其中有887 000人死于CHB晚期并发症，如肝硬化和肝癌等。因为共价闭合环状DNA（cccDNA）池的存在，乙肝的治疗并不能实现完全治愈，但可以达到“功能性治愈”[1]，即停止治疗后HBsAg仍保持阴性（伴或不伴抗-HBsAg抗体阳转）、HBV DNA检测不到、肝脏生物化学指标正常，肝组织明显改善。长期核苷（酸）类似物（NA）治疗HBsAg阴转率为0～3%，聚乙二醇干扰素 α（polyethylene glycol interferon α，PEG-IFNα） 单药治疗的HBsAg阴转率为3%～7%[3]，显然，需要更高效的药物来降低表面抗原从而实现功能性治愈。本文就HBsAg的结构、功能和近些年研发的靶向表面抗原的药物进展作一综述。
已知HBsAg由一组反应性抗原决定簇α和亚决定簇dy、wr组成，它们以等位基因对呈现[4]。所以，HBsAg 阳性血清可分为4种主要亚型：HBsAg/adw、HBsAg/ayw、HBsAg/adr和HBsAg/ayr。
HBsAg是HBV颗粒的包膜蛋白，具有不同结构域和糖基化状态的大（L）、中（M）、小（S）三种蛋白。电子显微镜下可以观察到表面抗原的三种形态：与空包膜对应的直径22 nm的球形缺陷颗粒、直径22 nm长度可变的细丝和直径42 nm的活性病毒粒子（Dane粒子）。这3种蛋白在内质网中合成，并在内质网和高尔基体中发生糖基化，它们的合成由提供3个不同长度的羧基末端共线型HBsAg蛋白的单一开放阅读框指定[5]。小蛋白（226个氨基酸）表达量最高，在病毒粒子和亚病毒颗粒中占主要成分，并且由于其有与细胞中宿主来源脂质的自组装的能力，所以在易位过程中不会被切割氨基酸残基，得以完整分泌。中蛋白（包含pre-S2结构域的55个额外残基）受相同启动子调控，分泌过程也与小蛋白类似。而大蛋白的转录受特定但较弱的启动子（pre-S1）调控。HBV大蛋白（L-HBsAg）包含pre-S2和pre-S1结构域的108-119个附加残基，是病毒粒子和细丝的重要组成部分，占包膜蛋白的10%～20 %。但在22 nm球形颗粒中，只占了2%[5-6]。小蛋白和大部分的大蛋白通过与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖 （heparan sulfate proteoglycan， HSPG） 位点[7]和牛磺胆酸钠共转运多肽 （sodium taurocholate cotransporting polypeptide， NTCP）结合而具有感染性。
2.1 启动感染过程
从结构上看，HBsAg位于病毒颗粒的最外层，是病毒与细胞相互作用的前哨， 它们与细胞表面的受体结合， 介导了病毒的吸附与侵入[8]。多项研究证实了pre-S1结构域中的肽在膜附着过程中必不可少，这些肽与人肝细胞膜特异性结合，并且可以被单克隆抗体抑制[9]。然而，在鉴定出与S-HBsAg蛋白特异性结合的肝细胞结合内皮因子Ⅱ后，也提出了S-HBsAg蛋白参与附着[10]。
2.2 包裹病毒成分
HBsAg是HBV颗粒的包膜蛋白，它可以结合HBV中和抗体anti-HBsAg，阻止这些抗体对完整病毒颗粒的中和作用，将病毒基因组传递给新的细胞[11]。
2.3 判断抗病毒治疗
HBsAg阳性是乙肝病毒感染的标志，临床上推荐以HBsAg水平来判断开始PEG-IFNα治疗的时机。指南中介绍[1]，对NA经治CHB患者中符合条件的优势人群联合PEG-IFNα可使部分患者获得临床治愈。治疗前HBsAg低水平（＜l 500 IU/mL）及治疗中HBsAg快速下降（12周或24周时HBsAg ＜200 IU/mL或下降＞1 lg IU/mL）的患者，联合治疗后HBsAg阴转的发生率较高。
2.4 第一代疫苗的基础
Murphy等[12]利用黑猩猩和被感染的人体血浆接种反应，发现针对HBsAg交叉反应α决定簇的抗体可预防HBV的adw和ayw亚型。
2.5 免疫调节
CD14是促进脂多糖（LPS）结合和Toll样受体（TLR-4）激活的LPS共受体，有学者提出HBsAg可能通过与CD14的关联触发TLR激活[13]，生化分析表明CD14的依赖性结合与HBsAg的来源有关，它改变了亚病毒颗粒的脂质分布[14]。更有研究发现[15]，HBV可通过其编码的HBsAg蛋白抑制TLR2下游的JNK信号通路从而选择性地抑制白细胞介素（IL）-12的产生，这从一方面解释了HBV逃避天然免疫导致持续感染的原因。
3.1 核酸聚合物 （NAP）
NAP属于单链硫代磷酸酯寡核苷酸（PS-ON）家族，具有广谱抗病毒活性。硫代磷酸化的结构保护寡核苷酸免受核酸酶攻击，同时还促进NAP与各种Ⅰ类包膜病毒和其他感染因子的融合糖蛋白中存在的两亲α-螺旋结构的疏水表面相互作用[16]。NAP的抗病毒作用取决于寡核苷酸的数量而不是序列，且作用机制与其两亲性有关[17]；
其选择性地阻止亚病毒颗粒[16-17]从携带 cccDNA 或整合的 HBV DNA[18]的肝细胞组装或分泌，从而允许通过宿主介导的免疫激活清除血清中的HBsAg。
3.1.1REP 2139 加拿大Replicor公司在研新药REP 2139已进入临床Ⅱ期联合用药试验中。REP 2139是40聚 体PS-ONs，序 列 为（2’OMeA，2’OMe-5-MeC）20，结构上腺苷和胞苷交替，包含所有胞嘧啶的 5-甲基化和所有核糖的 2’O-甲基修饰[19]。
REP 102研究，随访了12例患者接受REP 2139-Ca单药治疗的效果，其中9例转为与PEGIFNα或胸腺素α1的短期联合治疗，发现伴随着NAP单药治疗，血清HBsAg 降低2～7 lg IU/mL，血清HBV DNA降低3～9 lg拷贝/mL，以及出现血清抗HBsAg 抗体（10～1 712 mIU/mL）[20]。转为联合免疫疗法的患者中，有8例发生了HBsAg血清学清除，停药后达到HBV DNA＜116拷贝/mL，所有9例患者在停止治疗前都出现了血清抗HBsAg抗体滴度的显著增加。一项临床前研究[21]，在慢性鸭HBV（DHBV）感染模型体内评估了由REP 2139与富马酸替诺福韦二吡呋酯 （TDF） 和恩替卡韦 （ETV） 组成的联合疗法，研究发现当REP 2139与TDF或与TDF和ETV三药联合使用时，鸭的血清HBsAg和HBV DNA的降低速度更快，并且与TDF单药治疗相比，停止治疗后未观察到病毒反弹。REP 301研究纳入了乙肝e抗原（HBeAg）阴性、HBV/丁型肝炎病毒（HDV）合并感染的患者，发现REP 2139-Ca联合PEG-IFN的治疗实现了HBsAg血清学清除和抗HBsAg抗体快速升高（高达86 532 mIU/mL）[18]。此外，HBsAg 已降至＜1 IU/mL 的患者中加用PGE-IFNα前就出现大幅度的转氨酶升高，而且完成治疗的患者中取消所有治疗后，分别有4/11、6/11和7/11例对HBsAg、HBV DNA 和HDV RNA的功能控制目前可维持2年。401研究中，40例HBeAg阴性的患者先接受24周TDF单药治疗，后被随机均匀分配到实验组（48周TDF + PEG-IFNα +REP2139-Mg 10例/REP 2165-Mg 10例）和对照组（24周TDF + PEG-IFNα治疗后转为三联疗法继续治疗48周）；
治疗结束时，70.6%（35/40）的患者出现HBsAg下降 ＞1 lgIU/mL，67.5%（27/40）的患者HBsAg ＜1 IU/mL，60%（24/40）患者获得HBsAg清除（＜0.05 IU/mL），60%（24/40）的患者获得乙肝表面抗体（HBsAb）阳转；
34例患者完成48周随访，50% （17/34）的患者HBsAg＜1 IU/mL，41% （14/34）的患者获得HBsAg清除（＜0.05 IU/mL），50% （17/34）患者出现HBsAb阳性[22]。
3.1.2REP 2165 同样，Replicor公司在研的REP 2165也处于临床Ⅱ期、与TDF和PEG-IFNα的联合用药试验状态。REP 2165是一种REP 2139类似物，含有3个等距分布在整个聚合物中的未修饰核糖腺苷，单次给药后，在小鼠和食蟹猴中显示出与REP 2139相似的血浆清除率和组织分布，但器官和血液中的药物蓄积减少[23]。REP 2165的设计目的是通过将2OMe腺苷替换为2OH腺苷来更快地清除序列中的11、21和31位，增加了这些位置对核酸酶攻击的敏感性。
401研究中的NAP采用了REP 2165-Mg，治疗结束后总共有41% （14/34）的患者获得HBsAg血 清 学 清 除[22]。AASLD2020公 布 了TDF联 合REP 2165-Mg的无干扰素治疗方案在HBV/HDV合并感染的肝硬化患者中进行评估的结果，发现肝硬化患者对TDF、REP 2165-Mg治疗和伴随的转氨酶骤然升高耐受性良好，同时伴有HDV RNA清除、约3 lg IU/mL的HBsAg 降低和HBsAg血清学转换，证实了该无干扰素方案治疗HBV/HDV合并感染的晚期肝硬化患者是安全有效的[24]。
3.2 其他HBsAg抑制剂
3.2.1GST-HG131 中国福建的广生堂药业股份有限公司在研新药GST-HG131还处于临床Ⅰ期，具体试验结果尚待公布。EASL2021报告[25]，GST-HG131临床前特征，显示在无细胞毒作用[半数细胞毒性浓度（CC50） ＞100 μmol/L]条件下，能有效抑制HepG2.215细胞分泌 HBsAg[半数有效浓度（EC50） =3.4±nmol/L]、HBeAg（EC50=8 nmol/L）和HBV DNA（EC50=3.3±1.7 nmol/L），与恩替卡韦联合应用时，具有叠加作用。在AAV-HBV小鼠模型中，GST-HG131在给药28 d后，血清HBsAg呈剂量依赖性下降（约1 lg IU/mL），与替诺福韦联合使用可产生叠加活性。GST-HG131耐受性良好，对小鼠体重无明显影响。其抗病毒作用机制包括强烈抑制 HBsAg 分泌，涉及与末端核苷酸转移酶 4B（TENT4B）结合和抑制[26]，导致 HBV mRNA 的聚腺苷酸化尾部缩短，从而加速其降解。
3.2.2ALG-010133 美国Aligos Therapeutics公司在研新药ALG-010133处于临床Ⅰa/Ⅰb期。ALG-010133 是一种抑制S抗原转运的寡核苷酸聚合物（STOPS）分子，作用接近于NAP，在体外和CHB的试验中被发现可深度抑制HBsAg形成。其作用机制目前尚未完全阐明，被认为是通过与特异性蛋白相互作用来实现降低HBsAg水平，在这个过程起核酸适配体的作用[27]。
3.2.3LP-128 中国广州麓鹏制药有限公司在研新药LP-128的临床Ⅰ期研究已完成首例志愿者给药，旨在评估单次给药和多次给药的有效性和安全性[28]。其作用主要是减少宿主体内HBsAg包裹的乙肝空壳病毒数，恢复空壳病毒耗竭的免疫水平。目前还没有关于其作用机制的详细报道。
cccDNA作为稳定的病毒复制中间产物及病毒RNA转录的模板，是停止抗病毒治疗后病毒复制反弹的主要原因。实际上即使是急性HBV感染治愈后被感染者体内的HBV cccDNA也不能被完全消除，研究表明即使急性HBV感染患者治愈数十年后，如果使用免疫抑制剂等导致免疫功能低下，仍会发生HBV再激活，由此可见急性HBV感染患者治愈后依然依赖宿主特异性抗HBV的免疫监视作用[29]。因此，尽管清除患者体内cccDNA是理想的治疗终点，但目前仍难以实现，故美国肝病研究协会（AASLD）和欧洲肝病研究协会（EASL）提出功能性治愈目标，即实现HBsAg清除伴或不伴抗HBsAg抗体的血清学转换，而要实现功能性治愈则依赖于恢复宿主特异性抗病毒免疫功能，以达到持久控制HBV感染的目的[30]。
WHO提出2030年全面消灭肝炎包括乙型肝炎和丙型肝炎的目标，HBV病毒学治愈是指根除HBV cccDNA和/或所有感染的肝细胞，目前仍难以实现，而HBV的功能性治愈的标志主要是清除HBsAg伴/不伴抗HBsAg抗体血清学转换。在研的几种HBsAg抑制剂报告的临床试验结果十分可观，降低HBsAg的速度和效率优于现有的NA和PEG-IFNα，但是仅降低HBsAg也不能达到持久的功能性治愈，很有可能会出现病毒学反跳。随着降低病毒蛋白表达，诱导病毒蛋白降解或加速循环HBsAg清除等疗法及各种免疫相关疗法的发展，通过不断探索联合治疗的方法，未来几年内有望开发出更高效的实现HBV功能性治愈的疗法。
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