陈健鑫，魏玉倩，刘乐荷，孙会林，马焕成，伍建榕,**
(1.西南林业大学 云南省高校森林灾害预警控制重点实验室，云南 昆明 650224；
2.西南林业大学 西南地区生物多样性保育国家林业局重点实验室，云南 昆明 650224；
3.会泽县者海林场，云南 会泽 655000)
云南油杉（Keteleeria evelyniana）是广泛分布于中国西南地区的常绿针叶树种.显脉松寄生（Taxillus caloreasvar.fargesii）是半寄生性多年生种子植物，生长在海拔1 700～2 800 m 的山地针叶林或针叶阔叶混交林中，常寄生于油杉属、云杉属或铁杉属植物上，主要分布于云南迪庆州的德钦县，丽江市，大理州的巍山县、宾川县，楚雄州的禄丰县、双柏县以及玉溪市的易门县等地[1].显脉松寄生是滇中地区云南油杉天然林毁灭性生物灾害之一，对滇中云南油杉林危害严重，造成云南油杉中幼林生长量严重下降,甚至死亡.
重寄生是一种生物学的特殊寄生现象，指一种寄生物又被其他寄生物寄生.与重寄生菌相比，重寄生种子植物是一类不多见且专性寄生于与其相似功能群的其它寄生植物上的特殊寄生种子植物[2].硬序重寄生（Phacellaria rigidula）是重寄生属（Phacellaria）半寄生性亚灌木，是典型的重寄生植物.至今，重寄生属共被描述了8 个种，中国有6 个种的分布，云南有5 个种分布.重寄生属植物的寄主几乎全部为桑寄生科植物，两者的分布区较为一致，硬序重寄生的分布和寄主范围较广，主要寄主包括五蕊寄生、栗寄生、显脉松寄生、小红花寄生、滇藏钝果寄生、木兰寄生和双花鞘花等[3-4].硬序重寄生可寄生在显脉松寄生的枝条或根出条上（图1）.游铭佩与周德群[5]于1987 年在云南玉溪通海县观察发现了硬序重寄生寄生于显脉松寄生.郑兴峰等[6]发现硬序重寄生是云南主要林区的重寄生植物，其直接寄主是显脉松寄生和小红花寄生，并以显脉松寄生为主，间接寄主为云南油杉或梨属植物.
图1 云南油杉、显脉松寄生和硬序重寄生的相互组成关系Fig.1 The relationship of K. evelyniana,T.var.fargesii and K. evelyniana
目前，对于重寄生植物与其寄主之间关系的研究鲜见报道.李冬雪[3]通过组织解剖学的研究发现，硬序重寄生主要依靠其维管柱侵入寄主，随着硬序重寄生的不断发育，其在寄主体内的部分随之不断地深入和向两侧延伸.同时也从植物化学的角度证实了重寄生植物与其寄主间有较多相同的化合物，又有自己独特的部分，揭示了二者经过了长期的协同进化所达到的生态适应性.
截止目前，尚未见到滇中地区重寄生植物寄生在显脉松寄生上的报道.本研究首次报道了在滇中楚雄紫溪山国家自然保护区硬序重寄生寄生于云南油杉上的显脉松寄生，通过形态学和分子生物方法鉴定了植物的种类，并比较了不同样地间重寄生发生程度以及云南油杉病情指数的相关性，以期为云南油杉感染桑寄生植物的生物防治提供理论依据.
本研究试验地为云南省楚雄州北部紫溪山林场自然保护区内云南油杉林（24°59′03″～25°04′02″ N,101°23′01″～101°26′53″ E），海拔约1 773 m，地势平坦.紫溪山自然保护区属于中亚热带常绿阔叶林类型，采样地主要为云南松（Pinus yunnanensis）和云南油杉混交的人工林，混有少量旱冬瓜（Alnus nepalensis）及滇青冈（Cyclobalanopsis glaucoides），森林覆盖率达94.8%，属亚热带温凉湿润性气候，年平均气温12～17.2 ℃，年平均降雨量864～1 000 mm，平均相对湿度为80%～85%[7-8].
2.1 重寄生感染情况调查2015—2019年，每年的6—9 月在滇中楚雄紫溪山国家自然保护区，对寄生于云南油杉上的显脉松寄生及其重寄生植物进行调查.在保护区内设置20 m × 20 m 的样地5块，样地间距约200 m，在样地内随机抽取云南油杉样树10株，每株按东、南、西、北4 个方位各随机抽取被显脉松寄生的病枝5条，统计显脉松寄生和重寄生植物的数量.显脉松寄生和重寄生植物的寄生率采用公式（1）进行计算[9]，数据通过SPSS 20.0 进行统计分析，
2.2 显脉松寄生与云南油杉病情指数分级方法参照Hawksworth 和Wiens[10-11]在1972 年提出的dwarf mistletoe rating（DMR）系统描述和评估重寄生的侵染情况和云南油杉的受害情况（表1）.依据植物病害病情指数的公式计算重寄生侵染显脉松寄生的程度及显脉松寄生侵染云南油杉的程度（公式（2））[12]，数据通过SPSS 20.0 进行统计分析.式中，各级株数为各分级中的植株数；
各级代表值为病害分级的代表数值；
调查总株数为本次调查植株的总数；
最高一级代表数值为病害分级为Ⅳ的代表数值.
表1 显脉松寄生和云南油杉林病情指数分级Tab.1 Classification of disease index in T. caloreas var.fargesii and K. evelyniana forest
2.3 重寄生植物与显脉松寄生危害的关系在紫溪山云南油杉林分别选取重寄生植物发生严重和发生较少的2 块样地.参照DMR 分级系统和病情指数分级方法，统计2 块样地中油杉林受显脉松寄生危害的病情指数及显脉松寄生受重寄生植物危害的病情指数.将二者病情指数作为变量，通过SPSS 20.0 进行单因素方差分析，通过Graphpad Prism 8.0 绘制柱状图，以此分析重寄生植物对显脉松寄生害的影响.
2.4 显脉松寄生与重寄生植物的形态特征观察在紫溪山云南油杉自然保护区样地中采集重寄生植物及其直接和间接寄主的营养器官及繁殖器官，一份保存于变色硅胶自封袋中，尽量保证植株的完整性，另一份用70% FAA 溶液固定，实验材料均保存于西南林业大学森林预警与灾害控制重点实验室.
选取成熟的显脉松寄生的叶片和成熟的硬序重寄生小枝各50 份标本，测量记录叶片形态及类型、花序的类型及花各部分的结构，并用相机拍照保存形态特征照片.
茎组织结构的解剖观察以李冬雪[3]的常规石蜡切片法为基础，采用甲基丙烯酸甲酯（MMA）包埋，并通过GMA 塑料切片法进行切片（武汉赛维尔生物科技有限公司）.方法如下：组织块用70%FAA 固定48 h，依此浸入60%-70%-80%-90%-95%梯度酒精24 h 脱水，再用100%酒精浸泡24 h，重复脱水2次，最后用二甲苯透明24 h；
用浸塑液Ⅰ4 ℃浸塑24 h，浸塑液Ⅱ 4 ℃浸塑24 h，浸塑液Ⅲ4 ℃浸塑24 h，加入MMA 包埋液，抽真空5 h 后于37 ℃水浴聚合，通过硬组织切片机切片，厚度为10 μm，60 ℃过夜烤片；
切片浸入番红染液中染色5 s 后用自来水冲洗，再通过50%-70%-80%梯度酒精中各5 s 脱色，再浸入固绿染液中染色5 s后用无水乙醇脱水3次，脱色后的切片浸入干净的二甲苯中透明5 min，用中性树胶封片，通过光学显微镜（尼康，上海）观察显脉松寄生及硬序重寄生的茎组织结构及寄生关系.
2.5 显脉松寄生与重寄生植物的分子鉴定硅胶干燥的植物材料用液氮速冻后迅速研磨至粉末状，通过Ezup 柱式植物基因组 DNA 抽提试剂盒（上海生工）提取植物总DNA，提取完成后保存于-20 ℃冰箱.以植物总DNA 为模板，通过ITS 序列引物及叶绿体rbcL基因序列引物（表2）进行PCR 扩增.PCR 体系为25 μL，包括2× SanTaqPCR Master Mix 12.5 μL，上下游引物各1 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O 9.5 μL，PCR 体系为94 ℃预变性5 min后，进入以下循环：94 ℃变性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共循环35次，最后72 ℃延伸10 min[13-14].PCR 产物通过1%琼脂糖凝胶电泳检测，正确扩增的产物送昆明擎科生物技术有限公司直接测序.双端测序成功的序列用DNAMAN 8 拼接，序列提交至NCBI 数据库进行BLSAT 比对，选取部分同源性较高物种的ITS 序列与rbcL基因序列，通过MEGA 6 进行多重比对并串联序列.利用RAxML的最大似然法（maximum likelihood，ML）和PAUP的最大简约法（maximum parsimony，MP）构建系统发育树，确定物种的亲缘关系.
表2 本研究PCR 采用的引物Tab.2 Primers for PCR used in this study
3.1 显脉松寄生与重寄生的情况调查对云南油杉林的调查结果表明，云南油杉林中存在较多的显脉松寄生，部分显脉松枝条上可见重寄生.显脉松寄生和重寄生植物主要以小缀块的形式分布在山路边且向阳的云南油杉中，且在幼林中的分布较多，而在高大的油杉上分布较少.显脉松寄生的寄生率达64.00%±0.16%，病情指数达51.04±0.51，导致油杉幼林生长量严重下降，甚至死亡.硬序重寄生的寄生率达56.38%±0.13%，病情指数为54.16±0.18，受重寄生侵染的显脉松寄生生长势弱，叶片发黄脱落，枝条纤细（图2）.
图2 自然生境中硬序重寄生的间接寄主云南油杉（A，B）与直接寄主显脉松寄生（C）Fig.2 Phacellaria rigidula and its indirect host Keteleeria evelyniana (A,B) and its direct host Taxillus caloreas var.fargesii (C) in natural habitats
3.2 重寄生与显脉松寄生的关系通过分析显脉松寄生的重寄生害，结果表明，显脉松寄生的生长势随重寄生的严重等级的增大而减弱.根据DMR分级系统，危害等级为0 级时，显脉松寄生生长旺盛，危害等级在Ⅰ和Ⅱ级之间时，显脉松寄生出现黄化，枝条生长势减弱，危害等级在Ⅲ与Ⅳ级之间，显脉松寄生开始发生枯死.
分析显脉松寄生的重寄生害的病情指数与云南油杉显脉松寄生害的病情指数之间的关系，结果表明，随着重寄生植株侵染程度加重，显脉松寄生的死亡率增加，而云南油杉的生长情况较好.对比重寄生植物发生情况较重和较轻的2 块样地中云南油杉的病情指数，结果表明，重寄生发生情况较严重的样地，云南油杉生长情况较好.2017—2019年的病情指数分别为23.00 ± 1.41、25.50 ± 2.12 和31.50 ± 3.53.重寄生发生较少的样地，云南油杉生长势较弱，3 年的病情指数分别为53.75 ± 3.182、55.90 ± 1.26 和65.50 ± 3.54（图3）.重寄生侵染严重程度与云南油杉病情指数存在显著负相关性（P＜0.05），即重寄生发生越多，云南油杉病情指数较低，重寄生发生较少的样地，云南油杉病情指数越高.
图3 重寄生感染程度不同时样地的病情指数Fig.3 Disease index of different places with different degree of Phacellaria
3.3 显脉松寄生与重寄生的形态特征及解剖结构形态特征观察结果表明，显脉松寄生的叶片为线形至长椭圆形，长3～4.5 cm，宽7～12 mm，绿色至暗绿色，中脉明显；
花序具花4～5朵，花梗长3～4 mm，苞片为兜状，长约2 mm，果实为浆果，近球形，长5～8 mm（图4A，B），初步鉴定为显脉钝果寄生（变种）显脉松寄生（Taxillus caloreasvar.fargesii）.
图4 显脉松寄生与硬序重寄生的形态学特征Fig.4 Morphological characteristics of T. caloreas var.fargesii and P. rigidula
重寄生植物的花序圆柱状，细长坚硬，不分枝或极少分枝，簇生于显脉松寄生的枝条上，高10～25 cm，直径约1.5 mm（图4 A，C，D）.表面分布有不规则的沟纹，幼嫩时附茸毛，成熟时除花的四周外渐无毛.花单性，散生生于苞片或小苞片腋内（图4 C，D）.果实为核果，椭圆柱形，主要吸引鸟类取食从而进行种子散布[15-16].根据形态学测量数据和参考前人的描述将该重寄生植物初步鉴定为硬序重寄生（Phacellaria rigidula）.
显脉松寄生和重寄生接触部位的石蜡切片结果表明，二者的茎结构组成基本相似，由内到外分别为髓、木质部、韧皮部、皮层及表皮，但各组成部分面积占比不同（图5A）.显脉松寄生的髓是茎的中心，由薄壁细胞组成，韧皮部的面积占比小于木质部的面积占比，木质部清晰可见导管、木薄壁细胞、木纤维和木射线，皮层由薄壁细胞组成，细胞排列较为疏松（图5B）.重寄生的茎横切面可见髓为中心，髓射线与髓部难以区分，维管束包括韧皮部、形成层和木质部，韧皮部和木质部没有过多分化，形成层不明显，维管束排列较乱，表皮细胞为板状，排列比较紧密（图5C）.重寄生从表皮开始是侵入显脉松寄生，在接触部位二者的皮层细胞难以区分（图5D），重寄生的组织从寄主的两列导管沿射线方向向内侵入，深达木质部深处（图5E）.
图5 显脉松寄生与硬序重寄生的解剖特征Fig.5 Anatomical characteristics of T. caloreas var.fargesii and P. rigidula
3.4 显脉松寄生与重寄生植物的分子鉴定通过PCR 分别扩增显脉松寄生与重寄生的ITS 片段（约500 bp）及rbcL基因片段（约750 bp），基于双基因序列BLAST 比对结果表明，显脉松寄生与显脉钝果寄生（Taxillus caloreas）和广寄生（Taxillus chinensis）的相似度较高，重寄生与硬序重寄生（Phacellaria rigidula）、扁序重寄生（Phacellaria compressa）和聚果重寄生（Phacellaria glomerata）有较高的相似度.基于ITS+rbcL序列构建的系统发育树表明，楚雄地区云南油杉上寄生植物（TC-CX1，TC-CX2）与显脉钝果寄生聚为一支（图6A），重寄生植物（PR-CX1，PR-CX2）与重寄生属（Phacellaria）和寄生藤属（Dendrotrophe）处于一个进化支内，与异花寄生属（Dufrenoya）共聚为Amphorogyne 进化支（Amphorogyneclade）（图6B）.结合形态学特征与分子生物学分析，将楚雄地区云南油杉林上的寄生植物鉴定为显脉松寄生，重寄生植物鉴定为硬序重寄生.
图6 基于ITS+rbcL 序列构建显脉松寄生和硬序重寄生的最大简约树Fig.6 The maximum parsimony tree of T. caloreas var.fargesii and P. rigidula based on ITS+rbcL sequences.
本研究结合形态学特征与多位点序列分析鉴定了寄生于云南油杉上的显脉松寄生（Taxillus caloreasvar.fargesii）和寄生在显脉松寄生上的硬序重寄生（Phacellaria rigidula）.本研究依据花序和果形进行属下分类检索时发现，各物种间具有较高的形态相似性，且加之植物所处地理位置、环境及气候等因素的影响，植物的形态往往发生变化，给形态鉴定带来较大的困难[13].为增加鉴定的准确性，本研究采用植物核糖体rDNA 的ITS 片段及叶绿体rbcL基因进行系统发育分析，结果表明，上述2 个基因片段对显脉松寄生有较好的区分作用，而在重寄生植物的系统发育分析中，近缘种属之间的分辨还不充分.有研究指出，叶绿体matK基因、accD基因和clpP基因对植物近缘种属具有更高的分辨率，能对植物进行更加准确的鉴定[14].
云南油杉作为西南地区主要用材树种和风景林，广泛的分布于云南、贵州及四川等地.随着人工林面积逐渐增加，加之不合理的营林管理，使得云南油杉的病虫害发生严重[17-20].近年来，滇中云南油杉林中显脉松寄生的发生尤其严重，显脉松寄生簇生于云南油杉的主干和枝条上，被害木落叶早，叶片褪绿，叶形小，顶梢枯萎，甚至死亡.通过石蜡切片，我们发现随着硬序重寄生分不断生长和发育，其从寄主的皮层开始侵入，穿过形成层和韧皮部，侵入到寄主的木质部深处，与寄主建立营养关系.李冬雪[3]研究指出显脉松寄生的皮层细胞、髓射线及髓细胞等薄壁细胞中含有许多淀粉粒，为硬序重寄生的生长发育体重碳源和氮源；
郑兴峰[15-16]研究发现硬序重寄生的皮层细胞内有少量的叶绿体，因此，除了吸收寄主植物的水分及矿物质外，硬序重寄生生长发育所需的少部分能量也可由自身合成.
显脉松寄生作为寄生性种子植物的一大类，其防治方法主要通过传统的人工砍除病枝、内生吸根及根出条，阻止寄生植物的传播和延伸，但受地理条件和森林环境的影响，人工去除高枝的难度较大且成本较高，因此桑寄生对人工林的危害需要开拓新的方法来控制.截至目前为止，还未见通过硬序重寄生防治桑寄生害的研究报道，但作为自然森林生态系统的一个类群，其重要生态作用却不能忽视.重寄生植物对于生态系统中生物多样性的形成与作用、协同演化的机制以及植物营养方式的演化等方面的理论研究具有突出的优点，将其用于林业领域桑寄生科寄生植物危害控制等实际应用方面有较大的潜力.李冬雪[3]研究发现，在长期协同进化中，硬序重寄生侵染寄主植物的过程中会产生一系列的化学信号识别，寄主植物和重寄生植物在合成自身独特化学物质的同时，还在维管束进行着部分次生代谢物质的交流而产生相同的化合物.在今后的研究中，通过次生代谢物介导，利用硬序重寄生种子在显脉松寄生上萌发和侵入，使显脉松寄生生长势衰弱甚至死亡，从而使间接寄主云南油杉逐渐恢复生长势，对云南油杉林的保育和维持物种之间的生态平衡有着重要的意义.硬序重寄生作为防控显脉松寄生害的一种有益生物，采取正确的保护措施对其种群进行保护是有必要的，包括保护重寄生的自然生境、加强种质资源的人工保护及保护传播鸟类.因此，重寄生植物与其直接和间接寄主的互作、重寄生的识别与致病机制将成为今后的研究切入点.
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