杨 靖，卫 笑，付庆云，曹银萍，茹振钢，李友勇
(河南科技学院/现代生物育种河南省协同创新中心，河南新乡 453003)
1.1 试验材料与播种
BNS不育系由茹振钢教授提供[1,9]；
郑麦366是河南省农业科学院培育的一个优质强筋小麦品种，由中国农业科学院矮败小麦研究中心新乡基地惠赠。自2008年以来，BNS不育系一直在河南科技学院辉县小麦育种基地种植，历年从10月1日到11月18日分期播种，每8 d 1个播期，共设7个播期，用来观察BNS的育性等。作图群体构建的材料，包括父本郑麦366和母本BNS及其F1和F2，均在同年10月9日播种，此期是BNS的不育播种期[1-5]，也是当地小麦的适播期。F1自交产生F2群体种子时，为了保证不育基因的有效传递，人工杂交的F1在当年11月18日可育播期播种，植株抽穗后套袋，成熟后收获套袋穗，选择典型株穗混合脱粒，即F2种子，F2种子在不育播期播种，产生F2群体。材料田间种植方式：行长3.5 m，行宽0.3 m，BNS、郑麦366、F1种植株距12 cm，F2株距15 cm。
1.2 材料取样和表型调查
播种出苗后各世代单株依次标记，待生长至4个以上分蘖时，取亲本和F1各10个单株的第3、4分蘖叶片，剪1 cm段，混合后取样2 g；
F2全部单株分别取样，剪1 cm段，混合后取样2 g。所有样品液氮冷冻1 min，之后置于-72 ℃保存，备用。
取20株亲本和F1标记株，F2取所有标记单株，主茎和第1、2分蘖抽穗后全部套袋，第1分蘖套袋穗用于调查花粉可育率，成熟后收取主茎和第2分蘖套袋穗，计数小穗数和结实粒数；
自交结实率计算采用国内法，即自交结实率=第1、2小花结实粒数/(2×总小穗数)×100%。调查的麦穗首用主茎穗，备用第2分蘖穗。在标记植株第1分蘖始花当天，取主茎穗上、中、下3个部位的小穗各1个，用卡诺液固定，然后取固定的每个小穗第1小花的3枚花药，挤出花粉粒，用I2-KI染色，参照水稻和小麦的计数方法[1,3,10]对完全染为黑色且圆形的可育花粉粒数和花粉粒总数进行统计，每个片子取3个视野，共9个观察值，计算平均数，花粉可育率=可育花粉粒数/花粉粒总数×100%。
1.3 DNA的提取及不育、可育池的建立
参考Xing等[7]和孙慧慧等[8]的CTAB法提取幼叶基因组总DNA，用1%的琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测DNA的纯度和浓度。
按照BSA建立方法[11]，根据自交结实率和花粉可育率2个表型调查结果，取F2群体中表型值最低单株和最高单株各10株，各自的DNA等量混合，形成自交结实率可育池(A1)和不育池(B1)、花粉可育率可育池(A2)和不育池(B2)。
1.4 SSR引物的选择及检测
在Röder等[12]和Somers等[13]构建的SSR图谱上，从染色体的短臂端开始，每1～3 cM 选一个分子标记，首先选择单扩增产物位点标记，没有单扩增产物位点标记时选择二产物位点标记。从小麦GrainGenes网站(http://wheat.pw.usda.gov/cgi-bin/graingenes/browse.cgi?class =marker/)上获得引物序列，由上海生工生物技术有限公司合成。
参考Xing等[7]和孙慧慧等[8]的方法，使用Biometra Standard Gradient梯度PCR仪进行PCR检测。PCR反应体系为25 μL，包括超纯水18.2 μL，10×Buffer(Mg2+)2.5 μL，dNTP Mix(2.5 mmol·L-1each)2 μL，Taq DNA Polymerase(5 U·μL-1)0.3 μL，模板DNA(50 ng· μL-1)1 μL，上下游引物(10 μmoL·L-1)各0.5 μL。引物Xgwm、Xwmc、Xbarc的反应程序：94 ℃预变性3 min；
94 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，45个循环；
72 ℃延伸10 min；
12 ℃保存。引物Xcfd的反应程序：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s；
72 ℃延伸30 s，30个循环；
72 ℃延伸10 min， 12 ℃保存。扩增产物用2.5%的琼脂糖凝胶电泳检测，恒压100 V，电泳50 min。电泳结束后，用UVItec-FireReader凝胶成像分析仪观察并 保存。
1.5 遗传图谱的构建及QTL的定位
用BSA池筛选得到的多态性标记引物对F2群体各单株进行PCR扩增，PCR方法同1.4。用Mapmaker/Exp 3.0b[14]软件计算连锁标记的遗传距离，用WinQTLCart 2.5软件[15]处理各植株的连锁标记基因型和表型数据，检测QTL位点。
由于SSR标记在所属连锁群常有多位点和易位现象，为了准确定位SSR标记在BNS的连锁群，将连锁标记在BNS中重扩增，扩增产物由北京优博兰基因技术有限公司完成测序，将测序序列在小麦中国春参考基因组Chinese Spring RefSeq V2.1[16]中进行比对，定位连锁标记的物理位置，并定位QTLs的相对位置。用Mapdraw软件[17]绘制连锁标记和QTL的连锁图。
2.1 F2群体结实率调查结果
从表1可以看出，不育播期(10-09)播种的BNS和F1的自交结实率分别为0.95%和0，均表现为高不育，在可育播期(11-18)播种的BNS和F1的自交结实率分别为49.49%和41.23%；
而在不育播期和可育播期播种的郑麦366均可育，11月份播种的结实率有所下降，原因可能是后期发育快，不育小花较多。F2作图群体共143株，从表2可以看出，F2套袋自交结实率和花粉可育率平均值分别为16.33%和23.58%，偏态分布，均偏向不育性，说明该现象是不育显性所致，但BSA池极端表型与亲本一致，结实率最低为0，最高同可育亲本郑麦366。
表1 亲本及F1在不育和可育播期播种的自交结实率Table 1 Self-seed setting rate of parents and F1 generation plotted in sterile and fertile sowing date %
2.2 不育基因连锁SSR标记筛选结果
在小麦分子标记图谱上选用710对SSR标记引物，分别对BNS、郑麦366、F1、A1池、B1池、A2池和B2池进行DNA扩增，挑选出在亲本间和两对BSA池间均存在差异且差异表现一致的标记(不育基因的连锁标记)，最终筛选出530对有效扩增标记引物，其中在BNS和郑麦366亲本间存在110对多态性引物，与BNS不育基因连锁的标记引物有12对，分布在8条染色体上(表3)。部分标记的扩增电泳图见图1，可以看出，这些标记对郑麦366、BNS和F1的扩增图谱带型清晰，但个别标记(如Xgwm124和Xwmc795的A池)对两个不育池和可育池的扩增图谱带型与F1一致，主要原因是主效不育基因有2对，且具有显性特征，不育池中可能存在个别植株其中一个不育基因位点为纯合隐性可育，部分标记检测显示的父本带可能是这些位点的扩增产物，但不影响母本位点的引物筛选。
表2 F2群体2个表型BSA池的自交结实率和花粉可育率Table 2 Self-seed setting rate and fertile pollen rate in the two phenotypic BSA pools %
表3 亲本和BSA池筛选的共分离连锁SSR分子标记Table 3 Co-segregating SSR linkage markers screened from the DNA of parents and BSA pools
2.3 QTL定位分析结果
用12个多态SSR标记对F2群体143个单株进行DNA扩增，部分标记的扩增图谱见图2。读取各连锁标记扩增多态性，在Mapmaker/Exp 3.0b软件中计算连锁标记图距，发现共有3个多标记群和4个单标记群，第1个多标记群有4个标记，分别为Xbarc267(7B)、Xwmc517(7B)、Xwmc658(2A)和Xwmc617(4A/4B)；
第2个多标记群有2个标记，分别为Xwmc795(5A)和Xwmc752(5A)；
第3个多标记群有2个标记，分别为Xwmc396(7B)和Xbarc55(1B/2B)。其余4个标记Xcfd5(5B)、Xgwm124(1B)、Xwmc506(7D)和Xwmc332(2B)为单标记。从连锁标记 所属染色体看，2B、5A和7B染色体上的标记 较多。
M：DNA Marker；
P1：郑麦366；
P2：BNS；
F1：BNS×郑麦366杂交F1；
A1：自交结实率可育池；
B1：自交结实率不育池；
A2：花粉可育率可育池；
B2：花粉可育率不育池。图2同。
用WinQTLCart 2.5软件处理连锁标记图距数据，首先，用单标记分析法检测与不育QTL显著连锁的标记，结果共发现5个标记与不育QTL显著连锁，分别为Xbarc55(1B/2B)、Xwmc332(2B)、Xwmc517(7B)、Xwmc396(7B)和Xwmc752(5A)。然后采用区间分析法检测QTL位点，结果检测到2个主效不育QTL，分别与单标记Xwmc332和第3个多标记群连锁。
由于连锁标记Xbarc55中有二产物位点标记，因此连锁标记的所属染色体尚不能确定，为了准确定位连锁标记的连锁群，将各标记扩增产物序列在中国春基因组中进行比对，结果显示，Xbarc55位于2B染色体上，其他标记的所属染色体与标记来源图谱一致。Xbarc55和Xwmc396在Mapmaker/Exp 3.0b检测中是连锁的，可能是二者均连锁不育QTL所致。将Xbarc55(2B)与单标记Xwmc332(2B)连锁，按SSR图谱距离进行QTL检测，结果检测到1个QTL，与自交结实率和花粉可育率均相关，位置靠近标记Xwmc332，且贡献率较高，达13.20%，因此是一个主效不育QTL，命名为qBS1；
同样方法，将Xwmc396(7B)与Xwmc517(7B)连锁，重新进行QTL检测，结果也检测到1个QTL，位于两个标记之间，距Xwmc396较近，与自交结实率和花粉可育率也均相关，贡献率高达19.66%，表明也是主效不育QTL，命名为qBS2。
A～D分别为标记Xcfd5、Xwmc506、Xgwm124、Xwmc617的PCR结果。1～18：F2单株。
2.4 2个主效QTL的遗传参数
从表4可看出，qBS1和qBS2的表型变异解释率分别为13.20%和19.66%，表明qBS2的遗传效应大于qBS1。2个主效QTL的显性效应与加性效应的绝对值比值均大于1，表明这2个QTL的显性效应大于加性效应，且均具有显性效应。2个主效QTL的加性效应均为正值，说明其加性效应来源于母本BNS。2个主效QTL及其连锁标记的连锁图见图3。
表4 检测到与BNS不育相关的主效QTLTable 4 Major QTLs detected for BNS sterility
图3 BNS两个主效不育QTL及其SSR连锁标记的连锁图
BNS是一个新型小麦温敏雄性不育系，低温不育高温可育。前期研究初步发现，该不育系的不育性和育性恢复是非等位基因遗传方式，分别含有两对主效基因[4]，两个育性恢复基因已初步定位在1B和2B染色体上[7]，而本研究的目的是检测不育基因的QTL并初步定位其所在的染色体。利用BNS和它的完全保持系郑麦366的F2为作图群体，建立自交结实率和花粉可育率2对BSA表型池，用SSR分子标记筛选连锁标记并检测QTL，结果检测到2个主效QTL(qBS1和qBS2)，分别定位在2B和7B染色体上。
3.1 作图群体
对雄性不育与非雄性不育性状QTL定位群体的建立有很大区别。在雄性不育后代的分离群体中，由于不育个体不能传递后代，因此构建重组自交系和近等基因系异常困难，在这种背景下，F2是最佳作图群体。又由于不育系不结实，因此，产生F2群体的F1需在可育播期内播种，保证不育等位基因以同等概率传递，这是建立平衡基因频率F2群体的重要保证。本研究中F1是在11月18日播种的，是育性最高恢复播种期，建立的F2群体国内法平均结实率为16.33%，最高结实率为 69.68%，说明F2育性呈偏态分布，偏不育性，这种偏态是不育显性的结果，但它不影响连锁标记的筛选，因为高结实率的单株可以满足BSA池的建立。F2作图群体中最高结实率为69.68%，属高结实率水平，普通可育小麦品种的国内法自交结实率最高也在90%左右。
3.2 2B、5A和7B染色体与不育QTL连锁群
本研究连锁标记筛选结果显示，2B、5A和7B染色体上的连锁标记较多，占总连锁标记数的70%。在5A染色体上检测到1个QTL，但贡献率较小，且仅与自交结实率相关，因此认为是微效QTL。影响自交结实率的因素很多，除花粉育性外，颖壳张开特性、自交亲和性等均影响结实率，BNS的不育性是由于花粉败育，因此主效不育QTL必须与花粉育性相关。本研究在5A染色体上检测到2个连锁标记，其连锁的QTL虽不是主效的，但遗传性稳定，对不育性有较大影响，该不育位点及作用尚需继续观察；
2B染色体是小麦光温敏雄性不育基因和恢复基因的集中载体，如小麦光温敏雄性不育系BS20[18]、两极型光温敏不育系337S[19]的一个不育基因均定位在2B染色体上，光温敏D2型小麦雄性不育的质核互作型不育基因也与2B染色体相关[20]。本研究筛选到的连锁标记Xwmc332也位于2B染色体上，扩增产物比对发现，引物序列高度保守，因此认为是一个紧密连锁的分子标记，其连锁的QTL为主效QTL；
7B染色体是主效不育基因连锁群，本研究中有2个连锁标记位于该染色体上，而且前期恢复基因定位结果也表明该染色体上含有不育基因[7]。
3.3 QTL与连锁标记的距离
从连锁标记以及QTL初步定位的结果来看，标记与标记之间、标记与QTL之间的距离均比较大，但用单标记来检测QTL，标记与QTL是紧密连锁的，相关性达显著或极显著水平。测定距离较大的原因，主要来自三个方面，一是不同时期、不同遗传背景下测定的连锁图距可能不同，如Xbarc55和Xwmc332在Somers等[13]的SSR图谱位置和小麦GrainGenes网站的图谱位置也不完全相同；
二是交换热点的存在，品种间染色体结构具有多态性，连锁图谱和参考基因组分子图谱常常存在差异，甚至也有交错差异[21]，如中国春和BNS虽然都是普通小麦，但在品种演化上两个材料经历不同；
三是试验结果计算的交换值偏高，高交换值来自高重组个体数，如F2作图群体中标记的分离是一对位点，但表型的分离则是2对主基因及微效基因共同作用的结果，此外雄性不育的发生过程中，主效基因起决定作用，下游相关基因级联放大，任一因子异常，均可导致花粉败育[22]。研究发现，在BNS中有多个不育相关基因(如wtms1[8]、TaAPT2[23]、ATP1[9,24-25]、TA1和TA2[26]、IAA代谢途径相关基因[27]、小热激蛋白基因hsp23.5[28]等)，这些多基因重叠，也可使重组型个体数量增加，导致计算的交换值偏大，然而从BSA池筛选到的QTL单标记分析结果，可以看出标记与QTL之间的实际距离要小得多。
3.4 2个QTL的遗传效应
前期BNS不育性遗传学检测显示，2个不育基因的作用不等效，但作用累加[4]，本研究定位到的2个QTL的遗传效应也是不等效的，7B染色体上的qBS2比2B染色体上的qBS1遗传效应高。2个不育基因的非等效性，在BNS早期系BNY-S中也有反映，其不育率约为80%[8,23]，这可能是高效应位点的作用结果，BNS的完全不育性重组了新的不育基因[8]，推测新引入的不育基因为qBS2。本课题组前期在BNS与典型保持系、典型恢复系杂交组合中的测定结果显示，高效应位点的效应量是低效应位点的2～3倍[4,7]。BNS与其他小麦品种杂交，F1组合有完全不育、高不育、低不育和完全可育4种类型，这分别对应2对不育基因、高效应不育基因、低效应不育基因和不含不育基因的基因型。
用BNS和郑麦366的F2为作图群体，建立自交结实率和花粉可育率两个表型BSA池，选用分布在小麦21条染色体上的710个SSR分子标记，在BSA池中筛选出12个连锁标记，共检测到2个主效不育QTL，分别为qBS1和qBS2，其中qBS1位于2B染色体上，紧密连锁Xwmc332和Xbarc55 分子标记；
qBS2位于7B染色体上，紧密连锁Xwmc396和Xwmc517 分子标记，qBS2的遗传效应大于qBS1。这些结果为进一步精细定位不育基因提供连锁标记线索。