任倩倩，李宇航，杨 箭，罗仍卓么，王兴平，魏大为，马 云
(1.宁夏大学 农学院，银川 750021；
2.宁夏回族自治区反刍动物分子细胞育种重点实验室，银川 750021)
奶牛(Bostaurus)乳腺炎是奶牛养殖中最常见的炎症性疾病，通常由乳腺组织受到创伤或感染金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和大肠杆菌(Escherichiacoli)等病原微生物引起[1]，影响奶牛的健康、产奶量与乳品质，给奶牛场造成极大的经济损失，甚至威胁到人的饮食健康。近年来，关于奶牛乳腺炎预防与治疗在分子水平上的研究，取得了有效进展。蛋白酶体广泛存在于真核细胞的细胞质和细胞核中，可调节细胞生长周期和凋亡、调控基因转录以及DNA损伤修复等[2]，具有十分重要的生物学功能。
蛋白酶体激活亚基3(proteasome activator subunit 3，PSME3)又称Ki抗原、PA28γ和REGγ，是蛋白激活11s家族的成员，可结合并激活20s蛋白酶体[3]。PSME3通过泛素化和ATP非依赖性方式促进多种蛋白的降解，参与NF-κB[4]、TGF-β[5]和Wnt[6]等信号通路，通过调节p21、p16和c-Myc等因子而调控能量代谢、先天免疫、血管生成和细菌感染等多种生理学过程[7-9]，在口腔癌[10]、乳腺癌[11]、胰腺癌[12]、结肠癌[13]、肝癌[14]和甲状腺癌[15]等癌症组织中均高表达。此外，PSME3可负调控p53，参与调节细胞周期，抑制肿瘤发生并促进细胞凋亡[16]。近年来研究表明，PSME3作为Hippo信号通路的关键因子，在人类炎症中也发挥重要的调控作用[17]，然而，PSME3在奶牛乳腺炎中的作用研究还未见报道。因此，本试验检测PSME3基因在E.coli型乳腺炎奶牛乳腺组织中的表达情况，并进行PSME3基因CDS区的克隆、测序及功能预测分析，以期为进一步阐明PSME3在奶牛乳腺炎中的作用提供参考。
1.1 试验材料
用于基因克隆的奶牛乳腺组织样采集于宁夏本地屠宰场。选取36月龄，处于泌乳盛期的荷斯坦奶牛，屠宰后收集乳腺组织，剪成小块分装到冻存管中，放入液氮带回，于-80 ℃保存；
用于表达分析的组织样品来自于实验室前期保存的经E.coli诱导乳腺炎的奶牛乳腺组织[18]。
1.2 试验试剂
Trizol试剂、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser逆转录试剂盒和pMD19 T-Vector购自宝日医生物技术(北京)有限公司，2×TaqMaster Mix(Dye Plus)购自南京诺唯赞生物科技有限公司，DH5α感受态细胞购自北京索莱宝科技有限公司，柱式凝胶纯化回收试剂盒购自Omega(美国)公司，2×M5 HiPer SYBR Premix EsTaq(with Tli RNaseH)荧光定量试剂盒购自北京聚合美生物科技有限公司。
1.3 方法
1.3.1 总RNA提取与cDNA合成 分别将健康奶牛和E.coli诱导乳腺炎奶牛的乳腺组织块在液氮中迅速研磨，按照Trizol试剂说明书提取组织总RNA，0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，BioTek多功能酶标仪(SYNERGY LX)测定浓度与纯度。按照逆转录试剂盒说明书，去除总RNA中的基因组污染后，将总RNA逆转录为cDNA，-20 ℃保存，备用。
1.3.2 引物设计与合成 根据牛PSME3基因的序列(GenBank ID：XM_002696000)，利用Primer Premier 5.0软件设计PCR扩增引物和qPCR引物(表1)，由安徽通用生物有限公司合成，无菌无酶超纯水溶解。
表1 引物信息
1.3.3 奶牛PSME3基因的qPCR分析 cDNA浓度稀释为100 ng/μL，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)基因为内参基因，采用qPCR技术检测PSME3基因在健康奶牛和E.coli诱导乳腺炎奶牛的乳腺组织中的表达。反应体系为20.0 μL，包含：2×M5 HiPer SYBR Premix EsTaq10.0 μL，cDNA 1.0 μL，上下游引物各0.4 μL，ddH2O 8.2 μL。反应程序为：95 ℃预变性30 s；
95 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，共39个循环。基因的相对表达量用2-△△Ct法进行计算，数值用“平均 值±标准误”表示。利用SPSS 22.0和GraphPad 8.3的单因素方差分析进行组间基因表达水平的差异显著性分析，其中，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。
1.3.4 奶牛PSME3基因CDS区克隆与测序 以奶牛乳腺组织DNA为模板扩增PSME3基因的编码区，PCR反应体系为20.0 μL，包含：2×TaqMaster Mix 10.0 μL，模板cDNA 1.0 μL，上下游引物各0.8 μL，ddH2O 7.4 μL。PCR反应条件为：95 ℃预变性3 min，95 ℃变性30 s，52 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，34个循环，72 ℃终延伸5 min，4 ℃保存。用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物；
采用凝胶纯化试剂盒对产物进行纯化回收。将回收产物与pMD19-T Vector在 16 ℃连接1 h，并将连接产物转化至DH5α感受态细胞中，挑选阳性菌落，进行菌液PCR验证后，送北京奥科鼎盛生物科技有限公司测序。
1.3.5 奶牛PSME3基因CDS区的生物信息学分析 开放阅读框架:利用ORF Finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)分析PSME3基因的开放阅读框，并根据常用密码子推导该基因所编码的蛋白质序列。
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蛋白结构特征:利用PortParam在线工具(https://web.expasy.org/protparam/)进行PSME3蛋白的理化性质分析；
利用ProtScale在线工具(https://web.expasy.org/protscale/)分析PSME3蛋白的亲水性/疏水性；
利用NetPhos 3.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos-3.1/)进行磷酸化位点预测；
利用TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)进行跨膜区预测；
利用SignalP 5.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)进行信号肽序列预测；
利用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/)和SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/interactive)进行二级结构和三级结构预测。
蛋白功能：利用MEGA 4.0软件进行同源性比对与系统发育树构建；
利用NCBI中CD Search在线工具(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)进行结构域预测；
利用PSORT Ⅱ Prediction(https://psort.hgc.jp/form2.html)进行亚细胞定位；
利用String在线工具(https://string-db.org/)进行蛋白互作 分析。
2.1 总RNA提取与cDNA合成
组织RNA提取完成后，测定浓度，OD260/OD280值为1.8～2.0，表明RNA的纯度较高。0.8%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果显示条带完整，未见明显降解(图1)，可用于后续试验。
A.健康奶牛的乳腺组织；
B.E.coli诱导乳腺炎奶牛的乳腺组织
2.2 奶牛 PSME3 基因在奶牛乳腺组织中的 表达
以GAPDH为内参，利用qPCR技术检测奶牛PSME3基因在健康和E.coli诱导乳腺炎奶牛的乳腺组织中的表达量。结果表明，与健康奶牛相比，PSME3基因在E.coli诱导的乳腺炎奶牛的乳腺组织中的表达量显著上调(P<0.01)(图2)。
A.健康奶牛的乳腺组织；
B.E.coli诱导乳腺炎奶牛的乳腺组织；
**代表差异极显著(P<0.01)
2.3 奶牛 PSME3 基因CDS区克隆
以RNA逆转录的cDNA为模板，扩增PSME3基因的CDS区，用1%凝胶电泳进行检测，结果显示条带单一，与目标片段大小一致。测序结果显示均为单峰，片段大小为765 bp(图3)。
图3 奶牛 PSME3 基因CDS区PCR产物的电泳结果
2.4 奶牛 PSME3 基因CDS区生物信息学分析
利用OFR Finder分析奶牛PSME3基因mRNA的开放阅读框。结果表明，PSME3基因的起始密码子为ATG，终止密码子为TGA，CDS区全长为765 bp，编码254个氨基酸(图4)，分子质量为29.506 ku。
矩形框内为引物序列
2.5 奶牛PSME3蛋白结构特征分析
2.5.1 分子组成 由PortParam在线工具对上述PSME3蛋白质进行分析。结果表明，组成奶牛PSME3蛋白质的氨基酸共有20种，其中以亮氨酸(Leu)占比最大，为11.8%，色氨酸(Trp)占比最少，为0.4%(图5)。氨基酸残基中，带负电荷的残基总数(Asp+Glu)为41个，带正电荷的残基总数(Arg+Lys)有 36个。
图5 奶牛PSME3蛋白的氨基酸组成
2.5.2 亲水性/疏水性 奶牛PSME3蛋白的理化性质表明，该蛋白的理论等电点为5.69，总原子数有4 210个，原子结构为C1318H2136N352O396S8，不稳定指数为47.09，脂溶指数为104.33，平均亲水性为-0.371，为亲水性蛋白质(图6)。
图6 奶牛PSME3蛋白的亲水性/疏水性分析
2.5.3 磷酸化位点预测 用NetPhos 3.1在线工具对PSME3蛋白的磷酸化位点进行预测。结果表明，奶牛PSME3蛋白存在丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)和酪氨酸(Tyr)3种氨基酸的19个磷酸化位点(阈值>0.5)，其中，Ser位点8个，分别位于第17、24、156、174、191、222、247和248位；
Thr位点9个，分别位于第23、56、73、83、135、161、167、205和207位；
Tyr位点2个，分别位于第84和214位(图7)，这些磷酸化位点可能与蛋白质的活性有关。
图7 奶牛PSME3蛋白的磷酸化位点预测
图8 奶牛PSME3蛋白的二级结构预测
图9 奶牛PSME3蛋白的三级结构预测
图10 奶牛PSME3蛋白的跨膜区预测
2.6 奶牛PSME3蛋白功能分析
2.6.1 结构域 利用NCBI中Conserved Domains(CD Search)分析PSME3蛋白的保守结构域。结果发现，该蛋白包含PA28α和PA28β超家族结构域(图11)，表明该蛋白与典型的蛋白酶体家族成员PA28α和PA28β同源，可能通过上述结构域发挥激活蛋白酶体的作用。
图11 奶牛PSME3蛋白保守结构域预测
2.6.2 亚细胞定位与蛋白互作 通过Protein Subcellular Localization Prediction Tool在线工具对PSME3基因的CDS区编码的蛋白进行亚细胞定位，结果显示，该蛋白47.8%可能存在于细胞质中，34.8%存在于细胞核中，13%存在于线粒体中，4.3%可能在高尔基体中，表明该蛋白可能主要在细胞核和细胞质中发挥作用。此外，利用String在线工具分析蛋白质的互作网络(图12)，结果表明，PSME3蛋白可能与PSMA3、PSMA4、PSMA5、PSMB2、PSME2、FAM192A、NR1H3、IFNG、HSPA14和NOL7蛋白有相互作用。根据上述蛋白质的功能，推测奶牛PSME3可能调节细胞周期、增殖凋亡、血管生成、炎症反应与抗原呈递等过程。
图12 奶牛PSME3蛋白的互作分析
2.6.3 同源性 利用DNAMAN软件分析奶牛PSME3蛋白与小鼠(Musmusculus)、人(Homosapiens)、牦牛(Bosmutus)、绵羊(Ovisaries)、大鼠(Rattusnorvegicus)和黑猩猩(Pantorglodytes)等6个物种PSME3蛋白质的同源性，发现奶牛PSME3蛋白质与上述6个物种PSME3蛋白质序列同源性高达95.15%，表明各物种间PSME3蛋白质保守性较强，可能具有相似的生物学功能。并用MEGA 4.0软件中邻近法(Neighbor Joining，NJ法)构建系统进化树(图13)，奶牛与牦牛在系统进化树中距离最近，聚为一类，与大鼠距离最远。
图13 不同物种PSME3蛋白的系统进化树
奶牛乳腺炎的预防与治疗一直以来是亟需解决的难题，乳腺组织在E.coli和S.aureus等病原菌入侵后，白介素6(interleukin-6，IL-6)、白介素-1 beta(interleukin-1 beta，IL-1β)和肿瘤坏死因子ɑ(tumor necrosis factor ɑ，TNF-ɑ)等促炎细胞因子的表达量上升，发生炎症反应[19]。PSME3作为蛋白酶体激活11s家族的成员，于1990年在患有系统性红斑狼疮患者的血清中被发现，其家族成员还有PA28α和PA28β[20]。PSME3以泛素化和ATP非依赖性降解下游靶蛋白的作用方式受到广泛关注，在人乳腺癌[21]等疾病中的作用机制是近年来的研究热点。因此，本研究采用qPCR法检测PSME3基因在奶牛乳腺组织中的表达模式，并通过克隆获得PSME3基因的CDS区序列，采用生物信息学方法预测PSME3蛋白的生物学功能，为进一步探讨PSME3在奶牛乳腺炎中的调控作用提供参考。
本试验采用qPCR法检测PSME3基因在E.coli型奶牛乳腺炎乳腺组织中的表达量，与健康乳腺组织相比，PSME3基因在炎性组织中的表达量显著上调；
Sun等[22]研究表明，在E.coli或脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)处理过的小鼠巨噬细胞中，PSME3基因的mRNA和蛋白水平的表达量均上调，与本研究结果一致。此外，他们还发现PSME3可参与调控Toll样受体信号通路和NF-κB信号通路，与小鼠巨噬细胞炎症调节有关[22]。Khan等[23]研究发现，与PSME3互作的PSMA3在蛋鸡传染性支气管炎症反应中表达显著上调，调节NF-κB信号通路。因此，推测PSME3可能通过NF-κB信号通路调节奶牛乳腺组织炎性反应过程。
本研究通过PSME3基因所编码蛋白质的成分分析，发现亮氨酸占比最大(11.8%)。有报道显示，亮氨酸广泛存在于各种病毒和真核生物中，参与多种蛋白质的合成，调控机体代谢、细胞周期和免疫反应等生理过程[24-25]，推测奶牛PSME3蛋白有可能与上述生物学过程相关，有待于深入研究。通过对PSME3基因编码蛋白的理化性质分析，该蛋白为较稳定酸性亲水性蛋白，且不具有信号肽序列，无跨膜结构域，是非分泌型蛋白，主要分布在细胞质和细胞核中，可能促进细胞核中蛋白质代谢的后期或在控制生物体内活性肽水平中发挥特殊作用[26]。此外，对PSME3蛋白的磷酸化位点的预测也表明其功能的复杂性。
对PSME3基因编码蛋白的二级与三级结构分析发现，PSME3蛋白的二级结构由α-螺旋、无规则卷曲、延伸链和β-转角组成，其三级结构形成同源低聚物，由于单体螺旋之间的相互作用，使其高级结构十分稳定，这就保证PSME3蛋白在细胞需要或特定的条件下更高效地与蛋白酶体结合并发挥作用[27]。另外，本研究结果表明PSME3蛋白包含PA28α和PA28β结构域；
Masson等[28]研究发现，REGβ可能来源于REGα基因，并且REGα由γ亚基样前体系统的基因复制产生；
而Murray等[29]对果蝇来源的REGγ亚基的研究，证实其序列和功能与典型的REG蛋白家族的基因序列最为相似，调控细胞质膜生成、细胞增殖凋亡和炎性损伤等过程。
同源性和系统进化分析结果表明，PSME3蛋白在奶牛和其他物种间比较保守，说明PSME3蛋白在进化过程中具有很强的稳定性，也反映出该蛋白在多物种中发挥着稳定的生物学功能。蛋白互作分析结果表明，PSME3蛋白与PSMA3、PSMA4、NR1H3、HSPA14、PSMA5、PSMB2、PSME1、PSME2、IFNG和NOL7蛋白有互作关系。PSME3与PA28激活剂家族的其他蛋白如PSMA3和PSMA4具有较强的相互作用，此外，PSMA4[30]和NR1H3[31]调控人角质细胞和肝细胞的细胞周期和增殖，同时NR1H3[32]是糖尿病肾脏疾病的标志蛋白；
HSPA14[33]在人肝细胞癌症中高表达；
PSMA5在奶山羊和奶牛乳腺组织中与共轭亚油酸的生物合成有关[34]；
PSMB2[35]和PSME1[36]被发现在免疫反应中发挥抗原呈递的作用；
IFGN[37]可增强人和各种动物的免疫功能；
NOL7[38]在宫颈癌中是一种新型的肿瘤抑制因子，通过下调促血管生成因子和上调抗血管生成因子，在血管生成中起主要调控作用。结合PSME3蛋白在不同物种间具有很强的保守性，推测PSME3可能与上述蛋白相互作用调控细胞周期、增殖凋亡、血管生成以及免疫反应等生物学 过程。
奶牛PSME3基因在E.coli诱导乳腺炎的奶牛乳腺组织中的表达显著高于健康乳腺组织。奶牛PSME3基因的编码区全长为765 bp，编码由254个氨基酸组成的非分泌型蛋白质，含有PA28α和PA28β结构域，与PSMA3、PSMA4、NR1H3、HSPA14、PSMA5、PSMB2、PSME1、PSME2、IFNG和NOL7蛋白等相互作用，可能通过NF-κB信号通路参与乳腺细胞的质膜合成、细胞周期、增殖凋亡以及乳腺组织的免疫反应等多种生物学过程。该结果可为深入研究PSME3在奶牛乳腺炎中的功能和奶牛抗乳腺炎分子育种提供参考。
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